XIII. LOS VIRUS Y LA INGENIERÍA GENÉTICA

UN FENÓMENO comúnmente observado en el laboratorio consiste en que un fago capaz de propagarse en una cepa bacteriana determinada se replica en forma ineficiente cuando es crecido en otra cepa diferente. Se dice que estos fagos están restringidos cuando se encuentran en una cepa bacteriana diferente de aquella en la cual han sido propagados originalmente. Sin embargo, casi siempre una pequeña proporción del fago es capaz de evadir el estado de restricción y crecer de manera adecuada en la nueva cepa bacteriana, pero la progenie de este fago será incapaz de crecer en la cepa bacteriana que originalmente permitió la propagación del fago precursor. Estas observaciones sugieren que una modificación específica inducida por la nueva bacteria hospedera protege al fago de manera que no puede ser restringido dentro de la nueva cepa bacteriana, pero a la vez pierde la capacidad para crecer en la antigua cepa hospedera.

A principios de los años sesenta, Bertani, Weigle y Arber demostraron en forma independiente que la modificación inducida por el hospedero ocurre en el nivel del ADN del fago, y el fenómeno de restricción es consecuencia de la degradación por hidrólisis enzimática del ADN viral que no ha sido modificado. El ADN de la bacteria hospedera y otros ADNs presentes en dicha céla son modificados por la adición de grupos metilo (CH₃) en sitios específicos los cuales son normalmente reconocidos por un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción, las cuales solamente pueden degradar ADN no metilado. Así, la metilación de una base en particular presente en la secuencia de nucleótidos reconocida por la enzima, impide la hidrólisis y ruptura del ADN en la región de esta secuencia. Las enzimas de restricción son endonucleasas capaces de reconocer secuencias específicas de nucleótidos en el ADN de cadena doble y cortar ambas cadenas a la altura de dichas secuencias. Cada tipo de enzima de restricción reconoce una secuencia de nucleótidos en particular, la cual generalmente consta de cuatro a seis pares de bases. Una caracterísuca notable de los sitios donde actúan las enzimas de restricción consiste en que la secuencia de bases es palindrómica y el sitio de corte está localizado en forma simétrica con respecto al doble eje de simetría, por ejemplo: la secuencia reconocida por la enzima de restricción Eco Rl, obtenida de la bacteria E. coli, es:

FIGURA XIII.1. Recombinación in vitro de dos fragmentos de ADN.

En este caso, la unión AG presente en cada cadena de nucleótidos es hidrolizada por la endonucleasa.

Hasta la fecha han sido purificadas y caracterizadas más de cien diferentes enzimas de restricción. Su nomenclatura consiste en una abreviatura de tres letras correspondientes a la bacteria productora de la enzima (por ej.: Hae = Haemophilus aegyptum) más una letra en ciertos casos, que designa a la cepa bacteriana, y un número romano, por ej.: Hae III.

La caracterización de las enzimas de restricción ha permitido desarrollar técnicas refinadas para manipular los genes. El factor principal en estas técnicas está dado por la capacidad de ciertas enzimas de restricción para producir cortes escalonados (indentados) en sitios bien definidos presentes en las moléculas de ADN. La figura XIII.1 ilustra la manera en que estas enzimas pueden ser utilizadas: ADN procedente de dos fuentes diferentes es cortado con la misma endonucleasa (por ej.: Eco Rl) para producir fragmentos que poseen colas o términos de cadena sencilla cuyas secuencias de nucleótidos son complementarias. Incubando mezclas de ambos fragmentos en condiciones que favorecen la reunión de los mismos en presencia de la enzima ADN ligasa, es posible producir fragmentos de ADN híbrido también conocido como ADN recombinante.

Es relativamente sencillo introducir en una bacteria fragmentos de ADN por medio del proceso conocido como transformación. Sin embargo, dichos fragmentos de ADN no pueden replicarse y acaban siendo eliminados. Para evitar este problema, el fragmento de ADN es insertado en un vector o vehículo de clonación, el cual consiste en una molécula de ADN capaz de replicarse en forma autónoma. Entre los vectores más a menudo utilizados se encuentran los plásmidos bacterianos, que son pequeñas moléculas de ADN circular de cadena doble, los cuales generalmente contienen genes que codifican toxinas o enzimas capaces de inactivar ciertos antibióticos. Los plásmidos son cromosomas bacterianos accesorios y se diferencian del cromosoma principal en que los plásmidos no son estrictamente necesarios para la subsistencia y reproducción de la bacteria en cuestión. Los plásmidos pueden replicarse independientemente del cromosoma principal. Las bacterias pueden contener plásmidos tipo unicopia o multicopia (más de 20). En general, los plásmidos multicopia son pequeños y a menudo se utilizan como vehículos moleculares de donación. Por ejemplo, una célula de E. coli generalmente contiene 20 moléculas (copias) de plásmidos y sólo una molécula del cromosoma principal.

Otros vectores de donación están representados por ciertos bacteriófagos, particularmente el fago ha sido utilizado con éxito en diversos protocolos de manipulación genética. El fago l tiene dos grandes ventajas como vector de clonación. En primer lugar, el ADN recombinante puede ser preparado en grandes cantidades, ya que cada bacteria produce cientos de copias del ADN viral recombinante. Dicho ADN recombinante puede ser purificado fácilmente, ya que aparece como componente de las nuevas partículas del fago l . Utilizando cepas mutantes del fago l defectuosas en su capacidad para lisar la célula hospedera, es posible incrementar el rendimiento de nuevas partículas virales, las cuales pueden ser recuperadas induciendo artificialmente la lisis de la bacteria hospedera. El actual conocimiento detallado de la estructura del genoma del fago l permite construir mutaciones que incrementan la transcripción del ADN recombinante insertado en el genoma del fago l. Es posible eliminar grandes regiones del genoma del fago l que no son esenciales para la replicación del ADN viral y la lisis de la bacteria hospedera; las regiones eliminadas pueden ser substituidas por fragmentos de ADN recombinante procedente de las más variadas fuentes. Solamente se requiere un 25% del genoma del fago l para permitir el crecimiento lítico de este fago en la bacteria hospedera. Sin embargo, la eliminación del exceso de ADN viral, incluso de ADN que no contiene secuencias esenciales para la replicación del fago provoca que las nuevas copias de ADN no pueden ser empacadas en partículas virales. Esta última propiedad es muy útil en ingeniería genética, pues el ADN del fago l puede ser reducido en tamaño cortándolo con una enzima de restricción posteriormente, este ADN l puede ser mezclado con un ADN foráneo que ha sido cortado con la misma enzima de restricción, de manera que ambos tipos de ADN pueden recombinarse formando un ADN híbrido de suficiente tamaño como para ser introducido por transfección en bacterias susceptibles. El ADN recombinante puede replicarse en la bacteria, dando origen a nuevas moléculas de ADN recombinante con un tamaño suficiente para ser empacadas en partículas virales. Sólo las partículas que contienen ADN recombinante en cantidad equivalente a 7S-105% del ADN originalmente presente en el genoma del fago l pueden ser empacadas en nuevas partículas virales que producirán la formación de placas en un cultivo infectado; de esta manera, pueden ser distinguidas y separadas de aquellas partículas que contienen un ADN l de tamaño insuficiente debido a la ausencia de recombinación con el ADN foráneo (figura XIII.2).

FIGURA XIII.2. Esquema que muestra cómo puede ser utilizado un mutante del fago 1 como vector de clonación. La reacción de empacamiento selecciona las moléculas de ADN recombinante.

Actualmente existen métodos análogos a los empleados para donar ADN recombinante en bacterias, para propagar fragmentos de ADN recombinante en células eucarióticas. En este caso, los vectores de donación están representados por virus de animales como el SV4O, los adenovirus y algunos rotavirus, además de algunos virus de plantas útiles para clonar genes en células vegetales.