XIII. LOS VIRUS Y LA INGENIER�A GEN�TICA

UN FEN�MENO com�nmente observado en el laboratorio consiste en que un fago capaz de propagarse en una cepa bacteriana determinada se replica en forma ineficiente cuando es crecido en otra cepa diferente. Se dice que estos fagos est�n restringidos cuando se encuentran en una cepa bacteriana diferente de aquella en la cual han sido propagados originalmente. Sin embargo, casi siempre una peque�a proporci�n del fago es capaz de evadir el estado de restricci�n y crecer de manera adecuada en la nueva cepa bacteriana, pero la progenie de este fago ser� incapaz de crecer en la cepa bacteriana que originalmente permiti� la propagaci�n del fago precursor. Estas observaciones sugieren que una modificaci�n espec�fica inducida por la nueva bacteria hospedera protege al fago de manera que no puede ser restringido dentro de la nueva cepa bacteriana, pero a la vez pierde la capacidad para crecer en la antigua cepa hospedera.

A principios de los a�os sesenta, Bertani, Weigle y Arber demostraron en forma independiente que la modificaci�n inducida por el hospedero ocurre en el nivel del ADN del fago, y el fen�meno de restricci�n es consecuencia de la degradaci�n por hidr�lisis enzim�tica del ADN viral que no ha sido modificado. El ADN de la bacteria hospedera y otros ADNs presentes en dicha c�la son modificados por la adici�n de grupos metilo (CH₃) en sitios espec�ficos los cuales son normalmente reconocidos por un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricci�n, las cuales solamente pueden degradar ADN no metilado. As�, la metilaci�n de una base en particular presente en la secuencia de nucle�tidos reconocida por la enzima, impide la hidr�lisis y ruptura del ADN en la regi�n de esta secuencia. Las enzimas de restricci�n son endonucleasas capaces de reconocer secuencias espec�ficas de nucle�tidos en el ADN de cadena doble y cortar ambas cadenas a la altura de dichas secuencias. Cada tipo de enzima de restricci�n reconoce una secuencia de nucle�tidos en particular, la cual generalmente consta de cuatro a seis pares de bases. Una caracter�suca notable de los sitios donde act�an las enzimas de restricci�n consiste en que la secuencia de bases es palindr�mica y el sitio de corte est� localizado en forma sim�trica con respecto al doble eje de simetr�a, por ejemplo: la secuencia reconocida por la enzima de restricci�n Eco Rl, obtenida de la bacteria E. coli, es:

FIGURA XIII.1. Recombinaci�n in vitro de dos fragmentos de ADN.

En este caso, la uni�n AG presente en cada cadena de nucle�tidos es hidrolizada por la endonucleasa.

Hasta la fecha han sido purificadas y caracterizadas m�s de cien diferentes enzimas de restricci�n. Su nomenclatura consiste en una abreviatura de tres letras correspondientes a la bacteria productora de la enzima (por ej.: Hae = Haemophilus aegyptum) m�s una letra en ciertos casos, que designa a la cepa bacteriana, y un n�mero romano, por ej.: Hae III.

La caracterizaci�n de las enzimas de restricci�n ha permitido desarrollar t�cnicas refinadas para manipular los genes. El factor principal en estas t�cnicas est� dado por la capacidad de ciertas enzimas de restricci�n para producir cortes escalonados (indentados) en sitios bien definidos presentes en las mol�culas de ADN. La figura XIII.1 ilustra la manera en que estas enzimas pueden ser utilizadas: ADN procedente de dos fuentes diferentes es cortado con la misma endonucleasa (por ej.: Eco Rl) para producir fragmentos que poseen colas o t�rminos de cadena sencilla cuyas secuencias de nucle�tidos son complementarias. Incubando mezclas de ambos fragmentos en condiciones que favorecen la reuni�n de los mismos en presencia de la enzima ADN ligasa, es posible producir fragmentos de ADN h�brido tambi�n conocido como ADN recombinante.

Es relativamente sencillo introducir en una bacteria fragmentos de ADN por medio del proceso conocido como transformaci�n. Sin embargo, dichos fragmentos de ADN no pueden replicarse y acaban siendo eliminados. Para evitar este problema, el fragmento de ADN es insertado en un vector o veh�culo de clonaci�n, el cual consiste en una mol�cula de ADN capaz de replicarse en forma aut�noma. Entre los vectores m�s a menudo utilizados se encuentran los pl�smidos bacterianos, que son peque�as mol�culas de ADN circular de cadena doble, los cuales generalmente contienen genes que codifican toxinas o enzimas capaces de inactivar ciertos antibi�ticos. Los pl�smidos son cromosomas bacterianos accesorios y se diferencian del cromosoma principal en que los pl�smidos no son estrictamente necesarios para la subsistencia y reproducci�n de la bacteria en cuesti�n. Los pl�smidos pueden replicarse independientemente del cromosoma principal. Las bacterias pueden contener pl�smidos tipo unicopia o multicopia (m�s de 20). En general, los pl�smidos multicopia son peque�os y a menudo se utilizan como veh�culos moleculares de donaci�n. Por ejemplo, una c�lula de E. coli generalmente contiene 20 mol�culas (copias) de pl�smidos y s�lo una mol�cula del cromosoma principal.

Otros vectores de donaci�n est�n representados por ciertos bacteri�fagos, particularmente el fago ha sido utilizado con �xito en diversos protocolos de manipulaci�n gen�tica. El fago l tiene dos grandes ventajas como vector de clonaci�n. En primer lugar, el ADN recombinante puede ser preparado en grandes cantidades, ya que cada bacteria produce cientos de copias del ADN viral recombinante. Dicho ADN recombinante puede ser purificado f�cilmente, ya que aparece como componente de las nuevas part�culas del fago l . Utilizando cepas mutantes del fago l defectuosas en su capacidad para lisar la c�lula hospedera, es posible incrementar el rendimiento de nuevas part�culas virales, las cuales pueden ser recuperadas induciendo artificialmente la lisis de la bacteria hospedera. El actual conocimiento detallado de la estructura del genoma del fago l permite construir mutaciones que incrementan la transcripci�n del ADN recombinante insertado en el genoma del fago l. Es posible eliminar grandes regiones del genoma del fago l que no son esenciales para la replicaci�n del ADN viral y la lisis de la bacteria hospedera; las regiones eliminadas pueden ser substituidas por fragmentos de ADN recombinante procedente de las m�s variadas fuentes. Solamente se requiere un 25% del genoma del fago l para permitir el crecimiento l�tico de este fago en la bacteria hospedera. Sin embargo, la eliminaci�n del exceso de ADN viral, incluso de ADN que no contiene secuencias esenciales para la replicaci�n del fago provoca que las nuevas copias de ADN no pueden ser empacadas en part�culas virales. Esta �ltima propiedad es muy �til en ingenier�a gen�tica, pues el ADN del fago l puede ser reducido en tama�o cort�ndolo con una enzima de restricci�n posteriormente, este ADN l puede ser mezclado con un ADN for�neo que ha sido cortado con la misma enzima de restricci�n, de manera que ambos tipos de ADN pueden recombinarse formando un ADN h�brido de suficiente tama�o como para ser introducido por transfecci�n en bacterias susceptibles. El ADN recombinante puede replicarse en la bacteria, dando origen a nuevas mol�culas de ADN recombinante con un tama�o suficiente para ser empacadas en part�culas virales. S�lo las part�culas que contienen ADN recombinante en cantidad equivalente a 7S-105% del ADN originalmente presente en el genoma del fago l pueden ser empacadas en nuevas part�culas virales que producir�n la formaci�n de placas en un cultivo infectado; de esta manera, pueden ser distinguidas y separadas de aquellas part�culas que contienen un ADN l de tama�o insuficiente debido a la ausencia de recombinaci�n con el ADN for�neo (figura XIII.2).

FIGURA XIII.2. Esquema que muestra c�mo puede ser utilizado un mutante del fago 1 como vector de clonaci�n. La reacci�n de empacamiento selecciona las mol�culas de ADN recombinante.

Actualmente existen m�todos an�logos a los empleados para donar ADN recombinante en bacterias, para propagar fragmentos de ADN recombinante en c�lulas eucari�ticas. En este caso, los vectores de donaci�n est�n representados por virus de animales como el SV4O, los adenovirus y algunos rotavirus, adem�s de algunos virus de plantas �tiles para clonar genes en c�lulas vegetales.