IV. CÓMO SE IDENTIFICAN LOS AGENTES GENOTÓXICOS
LOS SISTEMAS BIOLÓGICOS DE PRUEBA
LOS sistemas de prueba se idearon con el propósito de evaluar en organismos de bioensayo los efectos producidos por agentes químicos ambientales, a los que el hombre está expuesto.
La producción de alteraciones hereditarias podría ser el resultado de la exposición crónica a agentes químicos poderosos, aun en concentraciones bajas. Como ya vimos, las mutaciones son cambios abruptos heredables en la composición y arreglo de los genes, los cuales están formados por ácido desoxirribonucleico. La mayoría de las mutaciones producen efectos deletéreos, otras efectos con poca o ninguna consecuencia y otras son ventajosas para el organismo. La magnitud de la proporción espontánea de mutación, la manera en que la selección actúa en las diferentes combinaciones génicas, y el tamaño y la estructura de las poblaciones humanas son suficientes para mantener una fuente rica de variabilidad. Sin embargo, una proporción de mutación grande y artificialmente creada es potencialmente capaz de producir una declinación en la salud genética, a menos que exista una selección grande en contra de los genes mutantes deletéreos. Este tipo de selección ocurre en las poblaciones naturales, pero en las poblaciones humanas la eficiencia de la medicina moderna tiende a reducir la selección en contra de los caracteres deletéreos.
Muchos genetistas creen que los genes constituyen el más preciado bien hereditario, y que cualquier deterioro en su calidad puede producir un decremento en la calidad de vida. El progreso en el control de las enfermedades infecciosas y en los procedimientos para detectar e identificar los desórdenes genéticos han revelado un residuo muy importante de desórdenes genéticos en las poblaciones humanas.
Un gran número de los pacientes que ingresan a hospitales e instituciones de salud ha revelado el origen genético de algunas de las enfermedades, de modo que el médico puede aliviar los síntomas de la enfermedad, mas no curarla. La gran variedad de mecanismos por los cuales los agentes físicos y químicos a los cuales estamos expuestos inducen mutaciones hace prácticamente imposible proponer esquemas generalizados de protección ante ellas, a no ser el impedir quedar expuestos a ellas.
Este tipo de consideraciones son las que han llevado a los genetistas a buscar sistemas de prueba capaces de detectar a los mutágenos ambientales. Sin embargo, resulta obvio que cuando los efectos de un aumento en la tasa de mutación en el hombre sean evidentes, el daño genético ya habrá ocurrido. Es posible también que gran parte del daño genético inducido pase inadvertido, ya que muchas mutaciones deletéreas están presentes en la poza génica humana. Por ello, en muchas ocasiones no es fácil identificar a la mutagénesis ambiental como la causa específica de anormalidades observadas en las poblaciones, pero gracias al empleo de los sistemas de prueba sí es posible identificar a los agentes químicos potencialmente mutagénicos antes de que provoquen un daño genético.
Las características que debe tener todo sistema de prueba son básicamente la sensibilidad y la capacidad de reproducirse. La sensibilidad de un sistema de prueba se define como la capacidad del sistema para detectar con facilidad y precisión estadística un pequeño efecto mutagénico inducido. La capacidad de reproducción implica la similitud de respuesta de un sistema en y entre laboratorios. Esto se logra solamente con el establecimiento de protocolos estandarizados y entrenando al personal para que adquiera niveles técnicos competentes. Esta capacidad de reproducción es también deseable en la forma de respuestas similares entre los diferentes sistemas, lo cual permitiría llegar a interpretaciones confiables de los datos positivos y negativos. Sin embargo, las diferencias en cuanto a organización y metabolismo entre procariontes y eucariontes hacen muy difícil la uniformidad en la respuesta.
Con la excepción de algunos virus, el material genético de todos los organismos es el ácido desoxirribonucleico, el cual se presenta en forma desnuda (procariontes) o asociado a proteínas (encariontes). Las mutaciones son eventos que en principio pueden detectarse en todos los organismos. El significado de una respuesta mutacional se hace más evidente en los organismos cuya genética se conoce extensivamente, ya que la respuesta puede representar uno o varios tipos de alteración genética.
La mutación es por lo tanto un error y consiste en diferentes tipos de cambios del material genético. La severidad de la mutación dependerá tanto de la importancia del gene alterado como de la naturaleza misma de la mutación. Por lo tanto, los diferentes sistemas de prueba deben detectar todo tipo de mutaciones, incluyendo aquellas que tienen efectos menores sobre la función génica. Los tipos de mutaciones que requieren ser detectadas, aunque no necesariamente de manera simultánea son:
1) Las mutaciones génicas entendidas como sustituciones de pares de bases, adiciones o supresiones. Las adiciones y supresiones pueden inactivar a un gene, lo que dependerá de la naturaleza misma del gene que se trata. Sin embargo, este tipo de alteraciones permiten al individuo sobrevivir y reproducirse, con lo cual las mutaciones génicas se establecen y se heredan a las siguientes generaciones.
2) Las alteraciones en la integridad del ADN. Éstas son medibles a través de la formación de aductos (lesiones premutagénicas), ligamientos cruzados intra e interbanda y rompimientos de una o dos hebras. Estas alteraciones pueden ser reparadas enzimáticamente, y si esto ocurre no constituyen mutaciones heredables.
3) Los cambios en la segregación cromosómica, lo que provoca cambios numéricos que comúnmente ocasionan una falta de equilibrio genético drástico, y letalidad en las etapas tempranas del desarrollo. Sin embargo, hay cambios numéricos viables, tales como la monosomia (presencia de un solo cromosoma de un par), y la trisomia (presencia de un cromosoma por triplicado).
4) Los cambios en la integridad cromosómica o estructurales, que consisten en supresiones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. Las supresiones pequeñas, en condición homóciga (alelos idénticos), y las grandes, en condición heteróciga (alelos distintos), son deletéreas y provocan desde el desarrollo de enfermedades genéticas en los individuos afectados hasta letalidad. Los rearreglos estructurales pueden ser detectados citológicamente, ya que comprenden porciones grandes de los cromosomas, y en organismos de bioensayo adecuados pueden detectarse cambios en las relaciones de ligamiento.
Aunque en la actualidad existen más de 150 sistemas de prueba, solamente se utilizan unos pocos para evaluar agentes químicos ambientales. De los más comúnmente empleados se utilizan los que detectan mutaciones, rompimientos cromosómicos (clastogenia) y recombinación mitótica (recombinación en células somáticas), por varias razones: detección de mutaciones en células germinales, predicción de la carcinogénesis, investigación de las propiedades bioquímicas de los compuestos y para cumplir con los reglamentos de los organismos reguladores. Estos sistemas son:
1) Microorganismos. Detecta alteraciones heredables.
2) Prueba microsomal. Tecnología in vitro que permite la activación de promutágenos en presencia de organismos indicadores (como Salmonella).
3) Prueba de micronúcleos. Los fragmentos cromosómicos o cromosomas con centrómero inactivado no se incorporan a las células hijas.
4) Prueba del locus específico. Método para detectar y medir las proporciones de mutación en un locus recesivo.
5) Daño al ADN. Detecta rompimientos en una hebra, ligamientos cruzados inter o intrabanda, y otros.
6) Reparación del ADN. Rastrea la reparación del ADN.
7) Síntesis no programada de ADN. Detecta la síntesis de ADN durante fases no sintéticas.
8) Inhibición del ADN. Detecta la inhibición en la síntesis del ADN.
9) Conversión génica. Se recobran marcadores desiguales que resultan del intercambio durante la recombinación.
10) Recombinación mitótica. Pérdida de la heterocigosis y recombinación intragénica (dentro del gene).
11) Análisis citogenético. Células o líneas celulares en cultivo para determinar aberraciones cromosómicas.
12) Intercambio de cromátidas hermanas. Detecta el intercambio de ADN en cromosomas en metafase entre los productos de réplica en loci homólogos.
13) Pérdida de cromosomas y no disyunción. Mide la falta de separación de cromosomas durante la mitosis o la meiosis.
14) Mutaciones en células somáticas de mamíferos. Utiliza la inducción y aislamiento de genes en células de mamíferos en cultivo, identificando los cambios genéticos.
15) Prueba de letales dominantes. Mide los cambios genéticos inducidos de manera dominante, que matan al cigoto. En mamíferos, la reducción en el tamaño de la camada, midiendo y contando el número de implantes que sobreviven.
16) Prueba vía el hospedero. Usa dos especies diferentes, como mamíferos y bacterias, para detectar cambios heredables causados por la conversión metabólica de los agentes químicos administrados en una especie huésped de mamífero.
17) Morfología del esperma. Apariencia anormal del esperma.
18) Prueba de translocaciones heredables. Transmisión de una translocación de una generación a la siguiente.
19) Transformación oncogénica. Utiliza criterios morfológicos para detectar diferencias citológicas entre células normales y tumorales.
20) Capacidad inhibidora de los fagos. Emplea una bacteria lisogénica (bacteria que lleva un fago temperado) para detectar cambios en las características genéticas de no infecciosos a infecciosos.
21) Análisis de fluidos corporales. Usa dos especies; la sustancia se administra al hospedero, del cual se toma y se prueba in vitro, midiéndose la tasa de mutación en la especie receptora.
Para que un agente químico sea lanzado al mercado debe conocerse antes su toxicidad, su destino ambiental y el uso al que va destinado. Sin embargo, si un agente químico ya está en el comercio deben definirse y cuantificarse los datos en cuanto al riesgo genético que conlleva su uso.
Existen dos formas o aproximaciones para probar agentes químicos:
A) Aproximación en hilera, que es muy utilizada para probar gran número de sustancias.
B) El empleo de una batería de pruebas.
Para el primer caso se emplea una sola prueba que debe ser rápida, confiable y barata. Los agentes son eliminados con base en la respuesta, así que pocas sustancias, las positivas, se dejan para ser evaluadas con pruebas más costosas y definitivas. Con la segunda aproximación se eliminan los agentes no genotóxicos, ya que muestran ser inactivos en todas las pruebas empleadas.
Por definición, un agente genotóxico es aquel que produce una respuesta positiva en cualquier bioensayo que se emplee y que mida cualquier punto genético terminal. Sin embargo, aunque un agente muestre ser genotóxico en un sistema o en una batería de pruebas no por eso representa un riesgo real para la salud, pero sí un riesgo potencial.
Un agente será no genotóxico cuando muestre ser inactivo en cualquier sistema de prueba que mida los diferentes tipos de genotoxicidad.
En última instancia los sistemas de prueba miden la habilidad de una sustancia para producir un efecto genotóxico de tipo cualitativo, de modo que éstos indican un probable riesgo para el hombre.
El análisis de riesgo comprende el desarrollo de estimados cuantitativos de mutaciones transmisibles. Este tipo de pruebas mide el daño en células germinales y los efectos en las progenies de los individuos tratados.
La batería de pruebas seleccionada debe ser capaz de identificar a los agentes que tienen una afinidad específica por el ADN; debe tener una capacidad metabólica apropiada, ser reproducible y transferible entre laboratorios.
La dosis es un criterio importante en el estudio de los agentes genotóxicos. Está la dosis de exposición, que es aquella a la que se exponen los organismos, expresada como concentración x tiempo; la dosis farmacológica, que es la cantidad que ingresa al individuo que se expresa en cantidad/peso corporal; la dosis blanco, que es la cantidad que llega al núcleo; la dosis molecular, que es la cantidad que se asocia con los sitios críticos de interacción en los ácidos nucleicos; la dosis colectiva poblacional, que es el promedio de exposición x del número de individuos expuestos; y la dosis genética significativa, que es la dosis que reciben las células germinales y que potencialmente puede afectar a la siguiente generación.
El empleo de condiciones impropias durante el tratamiento es una de las causas más comunes por las que se obtienen respuestas artificiales.
Las concentraciones sujetas a prueba deben ser lo suficientemente altas como para mostrar un efecto fisiológico en las células blanco, pero no tan altas como para producir efectos celulares secundarios que puedan confundir la interpretación de los resultados. Por ejemplo, las células de mamíferos en cultivo son particularmente susceptibles a la mutación y transformación causada por niveles iónicos o de pH que excedan las concentraciones fisiológicas normales.
La mayoría de los organismos vivos han desarrollado mecanismos para ajustarse a los cambios rápidos que ocurren en su ambiente. Así, las bacterias sujetas a cambios rápidos de pH sobreviven regulando el transporte de iones hacia adentro y hacia afuera de la célula. En los mamíferos, la regulación del pH se lleva a cabo no sólo por transporte iónico, sino también mediante un grupo muy complejo de atenuadores (buffers) orgánicos que existen en el suero y otros fluidos tisulares.
La reducción del pH en células de mamíferos en cultivo hasta niveles de 5.5 ± 0.5 produce efectos genotóxicos que se expresan en forma de rompimientos cromosómicos y mutaciones. Los cambios en los niveles osmóticos de los medios de cultivo también afectan la integridad de las células en cultivo. Los iones de sodio y de potasio en niveles superiores de 400 mOs/kg producen daño cromosómico, mutaciones y transformaciones celulares. Ashby (1988) sugiere un mecanismo a través del cual los altos niveles de iones monovalentes reemplazan al ion divalente de magnesio en la cromatina, lo que produce rompimientos. Distintos experimentos han demostrado que este mecanismo es dependiente de un umbral que está en los 400 mOs/kg.
Dosis-respuesta y citotoxicidad
La respuesta de los sistemas de prueba ante los agentes genotóxicos está dada por los receptores moleculares, con los cuales el agente químico interactúa para producir un efecto cuyo grado está determinado por la concentración del agente en el sitio reactivo.
Al inicio de cualquier experimento que pretenda entender los efectos de agentes químicos ambientales, se debe establecer el rango de dosis por emplear y la citotoxicidad del compuesto. Sin embargo, algunos agentes químicos son virtualmente no tóxicos y se selecciona la dosis con base en otros criterios. Los experimentos preliminares de toxicidad generan curvas de supervivencia que son muy útiles para la selección de las concentraciones que se van a emplear. El criterio toxicológico más frecuentemente empleado es la concentración letal media, que como ya vimos está definida como aquella que produce la mitad de individuos o células muertas por el tratamiento. A partir de ella se eligen dos o tres concentraciones más, con el objeto de obtener la curva dosis-respuesta. Por ello, la utilización de concentraciones muy altas seleccionadas con base en la muerte celular puede ser muy inapropiada para algunos agentes químicos.
Muchos agentes químicos tienen un rango de actividad muy estrecho, que suele coincidir con la solubilidad, el pH u otros factores tales como la osmolaridad. Otras sustancias químicas presentan un rango corto de respuesta en función de la dosis, lo que hace el análisis muy difícil. Este tipo de respuesta se debe a restricciones celulares en la permeabilidad y a otros factores que limitan la respuesta.
Como sucede en toda disciplina científica, en los experimentos de genética toxicológica es necesario emplear testigos o controles. Estos son de dos tipos: concurrentes e históricos. Los testigos concurrentes son los que se corren en paralelo con los experimentos, utilizando los vehículos o solventes empleados en la preparación y administración del agente sujeto a prueba. Éste es el control negativo. Además, a veces se utiliza un control positivo, que está constituido por aquellas sustancias de referencia cuya respuesta produce un efecto conocido en el sistema. Los controles históricos suelen estar conformados por los datos obtenidos a través del tiempo por un grupo de trabajo, con un determinado sistema de prueba y son muy valiosos, especialmente cuando el tamaño de la muestra de un control concurrente es muy pequeño; el empleo de este tipo de controles permite tomar decisiones adecuadas en cuanto a la respuesta del agente sujeto a prueba.
El análisis de datos debe hacerse en dos fases. La primera es la matemática, que permite evaluar y determinar estadísticamente los datos obtenidos. La segunda fase consiste en determinar el significado biológico de esos datos en función de los mecanismos de acción del agente, del riesgo potencial que representa su exposición, de las concentraciones necesarias para obtener una respuesta, etcétera.
La selección de la batería de pruebas que se va a utilizar debe hacerse cuidadosamente, tomando en consideración los siguientes puntos:
1) Las pruebas seleccionadas deben incluir diversos niveles filogenéticos, al menos células de dos tipos: procariontes y eucariontes.
2) La combinación de las pruebas debe detectar más de un tipo de daño genético que mida diferentes mecanismos de genotoxicidad.
3) Deben incluirse pruebas in vivo e in vitro.
4) Las pruebas in vitro deben poder detectar los metabolitos activos que se producen por la bioactivación de los agentes.
Mediante la aplicación de los resultados obtenidos en una batería de pruebas es posible establecer el riesgo de las poblaciones humanas expuestas a un determinado agente químico. La estimación potencial del riesgo se expresa en niveles de preocupación, más que en los aumentos esperados de enfermedad, lo cual concierne a la estimación real del riesgo.
Los niveles de preocupación en cuanto a la genotoxicidad de los agentes en función de las pruebas utilizadas y de la etiología de las enfermedades humanas, son:
1) Ensayos que miden la inducción de mutaciones génicas y de mutaciones cromosómicas, tanto numéricas como estructurales.
2) Ensayos que miden los intercambios de cromatidas hermanas, recombinación, reparación del ADN, rompimiento de una banda y ligamientos cruzados.
3) Ensayos que miden la formación de aductos o la inhibición en la síntesis del ADN o de su réplica.
