IV. C�MO SE IDENTIFICAN LOS AGENTES GENOT�XICOS
LOS SISTEMAS BIOL�GICOS DE PRUEBA
LOS sistemas de prueba se idearon con el prop�sito de evaluar en organismos de bioensayo los efectos producidos por agentes qu�micos ambientales, a los que el hombre est� expuesto.
La producci�n de alteraciones hereditarias podr�a ser el resultado de la exposici�n cr�nica a agentes qu�micos poderosos, aun en concentraciones bajas. Como ya vimos, las mutaciones son cambios abruptos heredables en la composici�n y arreglo de los genes, los cuales est�n formados por �cido desoxirribonucleico. La mayor�a de las mutaciones producen efectos delet�reos, otras efectos con poca o ninguna consecuencia y otras son ventajosas para el organismo. La magnitud de la proporci�n espont�nea de mutaci�n, la manera en que la selecci�n act�a en las diferentes combinaciones g�nicas, y el tama�o y la estructura de las poblaciones humanas son suficientes para mantener una fuente rica de variabilidad. Sin embargo, una proporci�n de mutaci�n grande y artificialmente creada es potencialmente capaz de producir una declinaci�n en la salud gen�tica, a menos que exista una selecci�n grande en contra de los genes mutantes delet�reos. Este tipo de selecci�n ocurre en las poblaciones naturales, pero en las poblaciones humanas la eficiencia de la medicina moderna tiende a reducir la selecci�n en contra de los caracteres delet�reos.
Muchos genetistas creen que los genes constituyen el m�s preciado bien hereditario, y que cualquier deterioro en su calidad puede producir un decremento en la calidad de vida. El progreso en el control de las enfermedades infecciosas y en los procedimientos para detectar e identificar los des�rdenes gen�ticos han revelado un residuo muy importante de des�rdenes gen�ticos en las poblaciones humanas.
Un gran n�mero de los pacientes que ingresan a hospitales e instituciones de salud ha revelado el origen gen�tico de algunas de las enfermedades, de modo que el m�dico puede aliviar los s�ntomas de la enfermedad, mas no curarla. La gran variedad de mecanismos por los cuales los agentes f�sicos y qu�micos a los cuales estamos expuestos inducen mutaciones hace pr�cticamente imposible proponer esquemas generalizados de protecci�n ante ellas, a no ser el impedir quedar expuestos a ellas.
Este tipo de consideraciones son las que han llevado a los genetistas a buscar sistemas de prueba capaces de detectar a los mut�genos ambientales. Sin embargo, resulta obvio que cuando los efectos de un aumento en la tasa de mutaci�n en el hombre sean evidentes, el da�o gen�tico ya habr� ocurrido. Es posible tambi�n que gran parte del da�o gen�tico inducido pase inadvertido, ya que muchas mutaciones delet�reas est�n presentes en la poza g�nica humana. Por ello, en muchas ocasiones no es f�cil identificar a la mutag�nesis ambiental como la causa espec�fica de anormalidades observadas en las poblaciones, pero gracias al empleo de los sistemas de prueba s� es posible identificar a los agentes qu�micos potencialmente mutag�nicos antes de que provoquen un da�o gen�tico.
Las caracter�sticas que debe tener todo sistema de prueba son b�sicamente la sensibilidad y la capacidad de reproducirse. La sensibilidad de un sistema de prueba se define como la capacidad del sistema para detectar con facilidad y precisi�n estad�stica un peque�o efecto mutag�nico inducido. La capacidad de reproducci�n implica la similitud de respuesta de un sistema en y entre laboratorios. Esto se logra solamente con el establecimiento de protocolos estandarizados y entrenando al personal para que adquiera niveles t�cnicos competentes. Esta capacidad de reproducci�n es tambi�n deseable en la forma de respuestas similares entre los diferentes sistemas, lo cual permitir�a llegar a interpretaciones confiables de los datos positivos y negativos. Sin embargo, las diferencias en cuanto a organizaci�n y metabolismo entre procariontes y eucariontes hacen muy dif�cil la uniformidad en la respuesta.
Con la excepci�n de algunos virus, el material gen�tico de todos los organismos es el �cido desoxirribonucleico, el cual se presenta en forma desnuda (procariontes) o asociado a prote�nas (encariontes). Las mutaciones son eventos que en principio pueden detectarse en todos los organismos. El significado de una respuesta mutacional se hace m�s evidente en los organismos cuya gen�tica se conoce extensivamente, ya que la respuesta puede representar uno o varios tipos de alteraci�n gen�tica.
La mutaci�n es por lo tanto un error y consiste en diferentes tipos de cambios del material gen�tico. La severidad de la mutaci�n depender� tanto de la importancia del gene alterado como de la naturaleza misma de la mutaci�n. Por lo tanto, los diferentes sistemas de prueba deben detectar todo tipo de mutaciones, incluyendo aquellas que tienen efectos menores sobre la funci�n g�nica. Los tipos de mutaciones que requieren ser detectadas, aunque no necesariamente de manera simult�nea son:
1) Las mutaciones g�nicas entendidas como sustituciones de pares de bases, adiciones o supresiones. Las adiciones y supresiones pueden inactivar a un gene, lo que depender� de la naturaleza misma del gene que se trata. Sin embargo, este tipo de alteraciones permiten al individuo sobrevivir y reproducirse, con lo cual las mutaciones g�nicas se establecen y se heredan a las siguientes generaciones.
2) Las alteraciones en la integridad del ADN. Éstas son medibles a trav�s de la formaci�n de aductos (lesiones premutag�nicas), ligamientos cruzados intra e interbanda y rompimientos de una o dos hebras. Estas alteraciones pueden ser reparadas enzim�ticamente, y si esto ocurre no constituyen mutaciones heredables.
3) Los cambios en la segregaci�n cromos�mica, lo que provoca cambios num�ricos que com�nmente ocasionan una falta de equilibrio gen�tico dr�stico, y letalidad en las etapas tempranas del desarrollo. Sin embargo, hay cambios num�ricos viables, tales como la monosomia (presencia de un solo cromosoma de un par), y la trisomia (presencia de un cromosoma por triplicado).
4) Los cambios en la integridad cromos�mica o estructurales, que consisten en supresiones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. Las supresiones peque�as, en condici�n hom�ciga (alelos id�nticos), y las grandes, en condici�n heter�ciga (alelos distintos), son delet�reas y provocan desde el desarrollo de enfermedades gen�ticas en los individuos afectados hasta letalidad. Los rearreglos estructurales pueden ser detectados citol�gicamente, ya que comprenden porciones grandes de los cromosomas, y en organismos de bioensayo adecuados pueden detectarse cambios en las relaciones de ligamiento.
Aunque en la actualidad existen m�s de 150 sistemas de prueba, solamente se utilizan unos pocos para evaluar agentes qu�micos ambientales. De los m�s com�nmente empleados se utilizan los que detectan mutaciones, rompimientos cromos�micos (clastogenia) y recombinaci�n mit�tica (recombinaci�n en c�lulas som�ticas), por varias razones: detecci�n de mutaciones en c�lulas germinales, predicci�n de la carcinog�nesis, investigaci�n de las propiedades bioqu�micas de los compuestos y para cumplir con los reglamentos de los organismos reguladores. Estos sistemas son:
1) Microorganismos. Detecta alteraciones heredables.
2) Prueba microsomal. Tecnolog�a in vitro que permite la activaci�n de promut�genos en presencia de organismos indicadores (como Salmonella).
3) Prueba de micron�cleos. Los fragmentos cromos�micos o cromosomas con centr�mero inactivado no se incorporan a las c�lulas hijas.
4) Prueba del locus espec�fico. M�todo para detectar y medir las proporciones de mutaci�n en un locus recesivo.
5) Da�o al ADN. Detecta rompimientos en una hebra, ligamientos cruzados inter o intrabanda, y otros.
6) Reparaci�n del ADN. Rastrea la reparaci�n del ADN.
7) S�ntesis no programada de ADN. Detecta la s�ntesis de ADN durante fases no sint�ticas.
8) Inhibici�n del ADN. Detecta la inhibici�n en la s�ntesis del ADN.
9) Conversi�n g�nica. Se recobran marcadores desiguales que resultan del intercambio durante la recombinaci�n.
10) Recombinaci�n mit�tica. P�rdida de la heterocigosis y recombinaci�n intrag�nica (dentro del gene).
11) An�lisis citogen�tico. C�lulas o l�neas celulares en cultivo para determinar aberraciones cromos�micas.
12) Intercambio de crom�tidas hermanas. Detecta el intercambio de ADN en cromosomas en metafase entre los productos de r�plica en loci hom�logos.
13) P�rdida de cromosomas y no disyunci�n. Mide la falta de separaci�n de cromosomas durante la mitosis o la meiosis.
14) Mutaciones en c�lulas som�ticas de mam�feros. Utiliza la inducci�n y aislamiento de genes en c�lulas de mam�feros en cultivo, identificando los cambios gen�ticos.
15) Prueba de letales dominantes. Mide los cambios gen�ticos inducidos de manera dominante, que matan al cigoto. En mam�feros, la reducci�n en el tama�o de la camada, midiendo y contando el n�mero de implantes que sobreviven.
16) Prueba v�a el hospedero. Usa dos especies diferentes, como mam�feros y bacterias, para detectar cambios heredables causados por la conversi�n metab�lica de los agentes qu�micos administrados en una especie hu�sped de mam�fero.
17) Morfolog�a del esperma. Apariencia anormal del esperma.
18) Prueba de translocaciones heredables. Transmisi�n de una translocaci�n de una generaci�n a la siguiente.
19) Transformaci�n oncog�nica. Utiliza criterios morfol�gicos para detectar diferencias citol�gicas entre c�lulas normales y tumorales.
20) Capacidad inhibidora de los fagos. Emplea una bacteria lisog�nica (bacteria que lleva un fago temperado) para detectar cambios en las caracter�sticas gen�ticas de no infecciosos a infecciosos.
21) An�lisis de fluidos corporales. Usa dos especies; la sustancia se administra al hospedero, del cual se toma y se prueba in vitro, midi�ndose la tasa de mutaci�n en la especie receptora.
Para que un agente qu�mico sea lanzado al mercado debe conocerse antes su toxicidad, su destino ambiental y el uso al que va destinado. Sin embargo, si un agente qu�mico ya est� en el comercio deben definirse y cuantificarse los datos en cuanto al riesgo gen�tico que conlleva su uso.
Existen dos formas o aproximaciones para probar agentes qu�micos:
A) Aproximaci�n en hilera, que es muy utilizada para probar gran n�mero de sustancias.
B) El empleo de una bater�a de pruebas.
Para el primer caso se emplea una sola prueba que debe ser r�pida, confiable y barata. Los agentes son eliminados con base en la respuesta, as� que pocas sustancias, las positivas, se dejan para ser evaluadas con pruebas m�s costosas y definitivas. Con la segunda aproximaci�n se eliminan los agentes no genot�xicos, ya que muestran ser inactivos en todas las pruebas empleadas.
Por definici�n, un agente genot�xico es aquel que produce una respuesta positiva en cualquier bioensayo que se emplee y que mida cualquier punto gen�tico terminal. Sin embargo, aunque un agente muestre ser genot�xico en un sistema o en una bater�a de pruebas no por eso representa un riesgo real para la salud, pero s� un riesgo potencial.
Un agente ser� no genot�xico cuando muestre ser inactivo en cualquier sistema de prueba que mida los diferentes tipos de genotoxicidad.
En �ltima instancia los sistemas de prueba miden la habilidad de una sustancia para producir un efecto genot�xico de tipo cualitativo, de modo que �stos indican un probable riesgo para el hombre.
El an�lisis de riesgo comprende el desarrollo de estimados cuantitativos de mutaciones transmisibles. Este tipo de pruebas mide el da�o en c�lulas germinales y los efectos en las progenies de los individuos tratados.
La bater�a de pruebas seleccionada debe ser capaz de identificar a los agentes que tienen una afinidad espec�fica por el ADN; debe tener una capacidad metab�lica apropiada, ser reproducible y transferible entre laboratorios.
La dosis es un criterio importante en el estudio de los agentes genot�xicos. Est� la dosis de exposici�n, que es aquella a la que se exponen los organismos, expresada como concentraci�n x tiempo; la dosis farmacol�gica, que es la cantidad que ingresa al individuo que se expresa en cantidad/peso corporal; la dosis blanco, que es la cantidad que llega al n�cleo; la dosis molecular, que es la cantidad que se asocia con los sitios cr�ticos de interacci�n en los �cidos nucleicos; la dosis colectiva poblacional, que es el promedio de exposici�n x del n�mero de individuos expuestos; y la dosis gen�tica significativa, que es la dosis que reciben las c�lulas germinales y que potencialmente puede afectar a la siguiente generaci�n.
El empleo de condiciones impropias durante el tratamiento es una de las causas m�s comunes por las que se obtienen respuestas artificiales.
Las concentraciones sujetas a prueba deben ser lo suficientemente altas como para mostrar un efecto fisiol�gico en las c�lulas blanco, pero no tan altas como para producir efectos celulares secundarios que puedan confundir la interpretaci�n de los resultados. Por ejemplo, las c�lulas de mam�feros en cultivo son particularmente susceptibles a la mutaci�n y transformaci�n causada por niveles i�nicos o de pH que excedan las concentraciones fisiol�gicas normales.
La mayor�a de los organismos vivos han desarrollado mecanismos para ajustarse a los cambios r�pidos que ocurren en su ambiente. As�, las bacterias sujetas a cambios r�pidos de pH sobreviven regulando el transporte de iones hacia adentro y hacia afuera de la c�lula. En los mam�feros, la regulaci�n del pH se lleva a cabo no s�lo por transporte i�nico, sino tambi�n mediante un grupo muy complejo de atenuadores (buffers) org�nicos que existen en el suero y otros fluidos tisulares.
La reducci�n del pH en c�lulas de mam�feros en cultivo hasta niveles de 5.5 ± 0.5 produce efectos genot�xicos que se expresan en forma de rompimientos cromos�micos y mutaciones. Los cambios en los niveles osm�ticos de los medios de cultivo tambi�n afectan la integridad de las c�lulas en cultivo. Los iones de sodio y de potasio en niveles superiores de 400 mOs/kg producen da�o cromos�mico, mutaciones y transformaciones celulares. Ashby (1988) sugiere un mecanismo a trav�s del cual los altos niveles de iones monovalentes reemplazan al ion divalente de magnesio en la cromatina, lo que produce rompimientos. Distintos experimentos han demostrado que este mecanismo es dependiente de un umbral que est� en los 400 mOs/kg.
Dosis-respuesta y citotoxicidad
La respuesta de los sistemas de prueba ante los agentes genot�xicos est� dada por los receptores moleculares, con los cuales el agente qu�mico interact�a para producir un efecto cuyo grado est� determinado por la concentraci�n del agente en el sitio reactivo.
Al inicio de cualquier experimento que pretenda entender los efectos de agentes qu�micos ambientales, se debe establecer el rango de dosis por emplear y la citotoxicidad del compuesto. Sin embargo, algunos agentes qu�micos son virtualmente no t�xicos y se selecciona la dosis con base en otros criterios. Los experimentos preliminares de toxicidad generan curvas de supervivencia que son muy �tiles para la selecci�n de las concentraciones que se van a emplear. El criterio toxicol�gico m�s frecuentemente empleado es la concentraci�n letal media, que como ya vimos est� definida como aquella que produce la mitad de individuos o c�lulas muertas por el tratamiento. A partir de ella se eligen dos o tres concentraciones m�s, con el objeto de obtener la curva dosis-respuesta. Por ello, la utilizaci�n de concentraciones muy altas seleccionadas con base en la muerte celular puede ser muy inapropiada para algunos agentes qu�micos.
Muchos agentes qu�micos tienen un rango de actividad muy estrecho, que suele coincidir con la solubilidad, el pH u otros factores tales como la osmolaridad. Otras sustancias qu�micas presentan un rango corto de respuesta en funci�n de la dosis, lo que hace el an�lisis muy dif�cil. Este tipo de respuesta se debe a restricciones celulares en la permeabilidad y a otros factores que limitan la respuesta.
Como sucede en toda disciplina cient�fica, en los experimentos de gen�tica toxicol�gica es necesario emplear testigos o controles. Estos son de dos tipos: concurrentes e hist�ricos. Los testigos concurrentes son los que se corren en paralelo con los experimentos, utilizando los veh�culos o solventes empleados en la preparaci�n y administraci�n del agente sujeto a prueba. �ste es el control negativo. Adem�s, a veces se utiliza un control positivo, que est� constituido por aquellas sustancias de referencia cuya respuesta produce un efecto conocido en el sistema. Los controles hist�ricos suelen estar conformados por los datos obtenidos a trav�s del tiempo por un grupo de trabajo, con un determinado sistema de prueba y son muy valiosos, especialmente cuando el tama�o de la muestra de un control concurrente es muy peque�o; el empleo de este tipo de controles permite tomar decisiones adecuadas en cuanto a la respuesta del agente sujeto a prueba.
El an�lisis de datos debe hacerse en dos fases. La primera es la matem�tica, que permite evaluar y determinar estad�sticamente los datos obtenidos. La segunda fase consiste en determinar el significado biol�gico de esos datos en funci�n de los mecanismos de acci�n del agente, del riesgo potencial que representa su exposici�n, de las concentraciones necesarias para obtener una respuesta, etc�tera.
La selecci�n de la bater�a de pruebas que se va a utilizar debe hacerse cuidadosamente, tomando en consideraci�n los siguientes puntos:
1) Las pruebas seleccionadas deben incluir diversos niveles filogen�ticos, al menos c�lulas de dos tipos: procariontes y eucariontes.
2) La combinaci�n de las pruebas debe detectar m�s de un tipo de da�o gen�tico que mida diferentes mecanismos de genotoxicidad.
3) Deben incluirse pruebas in vivo e in vitro.
4) Las pruebas in vitro deben poder detectar los metabolitos activos que se producen por la bioactivaci�n de los agentes.
Mediante la aplicaci�n de los resultados obtenidos en una bater�a de pruebas es posible establecer el riesgo de las poblaciones humanas expuestas a un determinado agente qu�mico. La estimaci�n potencial del riesgo se expresa en niveles de preocupaci�n, m�s que en los aumentos esperados de enfermedad, lo cual concierne a la estimaci�n real del riesgo.
Los niveles de preocupaci�n en cuanto a la genotoxicidad de los agentes en funci�n de las pruebas utilizadas y de la etiolog�a de las enfermedades humanas, son:
1) Ensayos que miden la inducci�n de mutaciones g�nicas y de mutaciones cromos�micas, tanto num�ricas como estructurales.
2) Ensayos que miden los intercambios de cromatidas hermanas, recombinaci�n, reparaci�n del ADN, rompimiento de una banda y ligamientos cruzados.
3) Ensayos que miden la formaci�n de aductos o la inhibici�n en la s�ntesis del ADN o de su r�plica.
