VI.LA BIOLOG�A ESTRUCTURAL Y EL ADN RECOMBINANTE: EN LA FORMA EST� LA CLAVE

AL CONTEMPLAR el complejo funcionamiento celular en el cual los genes conciertan la interacci�n de mir�adas de mol�culas, donde se transforman sustancias de manera intrincada, vemos aparecer forma y funci�n. �D�nde se localiza el secreto mas �ntimo de este proceso? �C�mo se encuentran las mol�culas unas con otras? �A qu� se debe que una enzima sea capaz de localizar y transformar la sustancia sobre la cual act�a? Las respuestas a estos interrogantes se derivan, en su forma m�s contundente, de la forma espacial de las mol�culas. La disciplina que desarrolla y utiliza t�cnicas experimentales para averiguar la estructura tridimensional de las mol�culas biol�gicas, la biolog�a estructural, constituye una de las vertientes m�s importantes de la actividad cient�fica moderna. Ya se mencion�, en el cap�tulo II, que fue precisamente el conocimiento estructural el que inici� la revoluci�n de la gen�tica molecular.

En este cap�tulo revisar� algunos de los conceptos y desarrollos m�s interesantes del campo. El tema es, para m�, particularmente atractivo: en mi l�nea de investigaci�n utilizamos los datos de la estructura de las prote�nas y el ADN recombinante para generar nuevas versiones, con atributos mejorados, de las prote�nas naturales. Es mi sincero deseo el poder transmitir al lector el sentido est�tico y el enorme potencial que se originan del conocimiento de las estructuras moleculares biol�gicas.

LAS T�CNICAS EXPERIMENTALES

Si revisamos nuestras primeras experiencias con el microscopio, durante nuestras clases de biolog�a, quiz� recordemos que para lograr ver cosas m�s y m�s peque�as, hab�a que tomarse m�s y m�s trabajos. Para amplificar cien veces la muestra s�lo necesit�bamos alumbrar y enfocar bien; pero si se trataba de amplificarla mil veces, entonces usabamos aceite de inmersi�n para acercarnos m�s a la muestra; las cosas se pon�an dif�ciles. Quiz� recordemos tambi�n al maestro de biolog�a dici�ndonos que para ver cosas aun m�s peque�as, la luz ya no funciona. En efecto, la longitud de onda de la luz visible tiene una magnitud tal que no permite continuar los procedimientos �pticos de manera indefinida. Recurrimos as� al microscopio electr�nico. De esta forma ya podemos ver estructuras dentro de la c�lula; �lo que la luz no alcanzaba, los electrones si revelan! Desafortunadamente, el mismo principio que limita la utilizaci�n de la luz, tambi�n la limita con los electrones. Los �tomos y las mol�culas no se pueden ver directamente.

Para deducir la estructura espacial de la materia, la manera como se asocian unos �tomos con otros en tres dimensiones, requiere aplicar otros desarrollos de la f�sica: la cristalograf�a de rayos X y la resonancia magn�tica nuclear (RMN). A partir del conocimiento �ntimo de la naturaleza de los �tomos y la radiaci�n electromagn�tica, en los �ltimos 50 a�os se han desarrollado t�cnicas de incre�ble complejidad y elegancia, que permiten deducir, a partir de numerosas observaciones experimentales, la posici�n precisa de los miles de �tomos que constituyen una mol�cula de prote�na, o hasta de las muchas mol�culas que constituyen un virus completo.

Aunque est� fuera de los prop�sitos de este libro una descripci�n t�cnica de estos procedimientos, destacar� algunos de sus rasgos m�s importantes.

CRISTALOGRAF�A DE RAYOS X

Los rayos X interaccionan con las sustancias desvi�ndose ligeramente. La magnitud de esta desviaci�n depende de la densidad electr�nica que encuentren a su paso. Por esto los materiales que contienen �tomos de metales (por ejemplo, el plomo o el calcio de los huesos), muestran zonas oscuras en una radiograf�a, dado que los metales son muy densos en electrones. Los rayos X tambi�n se dispersan o difractan cuando atraviesan materia org�nica, pero m�s ligeramente. En principio, como el patr�n de difracci�n resultante del paso de los rayos X depende de la estructura de la materia que atraviesa, podr�amos inferir �sta de aqu�l. El problema es que no podemos observar el patr�n de difracci�n de una sola mol�cula: la se�al seria demasiado d�bil. Para solucionar este problema se recurre a la observaci�n de los patrones de difracci�n generados por cristales. Cuando hablamos de cristal, de manera rigurosa nos referimos a un fen�meno natural realmente bello. Las mol�culas que pasan suavemente de estar disueltas al estado s�lido, lo pueden hacer acomod�ndose ordenadamente una al lado de la otra, en una l�tice o arreglo tridimensional. La manifestaci�n macrosc�pica de este fen�meno es la apariencia pulida y transparente que tienen los cristales, y sus formas geom�tricas caracter�sticas. Pero internamente, existe un orden perfecto. Todas las mol�culas se encuentran orientadas de la misma manera. As� pues, al manipular un cristal de dimensiones macrosc�picas (por ejemplo un mil�metro), estamos manipulando de manera concertada todas las mol�culas que lo constituyen, obteniendo la misma orientaci�n de cada una de ellas respecto al observador. �O a un haz de rayos X! Es as� como, disponiendo de cristales, se pueden obtener patrones de difracci�n de rayos X observables, porque provienen de muchas mol�culas, y coherentes, porque las mol�culas est�n todas igualmente orientadas respecto al rayo. De estos patrones de difracci�n puede inferirse la estructura individual de las mol�culas que conforman los cristales.

Por desgracia, esto es m�s f�cil decirlo que hacerlo. Para empezar hay que ser capaz de obtener los cristales. Aunque se ha logrado hacer que cristalicen gran n�mero de mol�culas interesantes, en el caso de las prote�nas, de crucial importancia, no es nada f�cil. La labor del cristal�grafo implica adem�s muchos pasos posteriores a la cristalizaci�n. Hay que colectar datos, preparar derivados de los cristales originales, reducir los datos mediante complejas ecuaciones, preparar un modelo molecular que se ajuste a estos datos y refinar el modelo en muchos intentos sucesivos.

Algunas de las im�genes m�s bellas que ilustran los libros de bioqu�mica y biolog�a molecular provienen del arduo trabajo de los cristal�grafos. Y su utilidad tambi�n es enorme: del an�lisis de estas im�genes tridimensionales se derivan el secreto de las interacciones moleculares, de la vida misma.

La primera estructura tridimensional de una prote�na fue obtenida mediante el trabajo pionero de Max Perutz, quien requiri� de 22 a�os para lograr su objetivo. Incluso, hasta hace poco m�s de una d�cada, la resoluci�n de una estructura proteica pod�a considerarse una empresa para buena parte de la vida. Afortunadamente, el avance de la metodolog�a ha sido impresionante. Hoy d�a se conjugan varios factores que permiten un flujo continuo de nuevas estructuras. En primer lugar, como puede entenderse f�cilmente, la potencia y abaratamiento de las computadoras modernas simplifica y acelera significativamente el trabajo de cristalograf�a.

Adicionalmente, la posibilidad de clonar y sobreexpresar genes ha abierto la puerta para trabajar con prote�nas que antes resultaban inaccesibles. Los cristal�grafos se han asociado tambi�n a los sincrotrones, construidos para investigaciones de f�sica at�mica, pero que generan como subproducto rayos X de gran intensidad y versatilidad. El ciclo en el que los avances cient�ficos y tecnol�gicos se potencian unos a otros se observa con claridad: son precisamente los �ltimos 10 o 15 a�os en los que ha registrado un impresionante avance en la biolog�a estructural. Justo en este periodo surgi� el ADN recombinante y el crecimiento explosivo de la inform�tica.

RESONANCIA MAGN�TICA NUCLEAR

En los �ltimos a�os ha madurado otra t�cnica que permite tambi�n deducir la estructura molecular: la resonancia magn�tica nuclear; que aplicada a prote�nas, complementa la cristalograf�a de rayos X.

La adaptaci�n de la RMN al trabajo con mol�culas grandes surgi� de avances tecnol�gicos recientes. Nuevamente, se requiere colectar y procesar cantidades masivas de datos. Adem�s, se necesitaron aparatos que trabajaron con frecuencias de ondas de los que antes no se dispon�a. Los nuevos aparatos requieren el uso de superconductores para generar los campos magn�ticos. La gran virtud de la RMN es que puede usarse para analizar mol�culas en soluci�n, es decir, en su ambiente natural. La naturaleza de la t�cnica es tal, que no es importante que todas las mol�culas est�n orientadas de la misma manera.

Con la RMN los datos observados se traducen en una serie de distancias y �ngulos entre los �tomos. A partir de esta lista de �ngulos y distancias el espectroscopista se da a la tarea de construir un modelo molecular que satisfaga las medidas observadas experimentalmente.

El esfuerzo de los investigadores de este campo fue distinguido con el Premio Nobel de qu�mica en 1991, otorgado al investigador suizo Richard Ernst y los l�mites de la t�cnica se han extendido grandemente. Por desgracia, este m�todo no permite determinar la estructura de mol�culas grandes, tales como muchas prote�nas y agregados macromoleculares.

Las t�cnicas experimentales para la determinaci�n de estructura han generado un n�mero muy importante de resultados. Hoy disponemos de m�s de 5 000 diferentes estructuras de �cidos nucleicos y prote�nas, que representan cerca de 500 diferentes arquitecturas (el resto est� constituido por variantes de las mismas prote�nas, por ejemplo, provenientes de diferentes organismos o interactuando con sus mol�culas blanco, etc.). En el recuadro Vl.1 se muestran representaciones esquem�ticas de algunas de la estructuras de biomol�culas determinadas hasta la fecha. Desafortunadamente, esta informaci�n est� cada d�a m�s rezagada de los datos conocidos sobre secuencia (v�ase el cap�tulo IV). Esto genera una urgente necesidad de desarrollar sistemas para predecir la estructura tridimensional a partir de datos de secuencia.

RECUADRO VI. 1. Estructura de las biomol�culas En el material biol�gico encontramos asociaciones de �tomos de todos los tama�os. Un solo �tomo, el ion litio, por ejemplo, puede tener profundos efectos biol�gicos (como el que se usa en el tratamiento de la enfermedad maniaco-depresiva). Varios �tomos combinados qu�micamente dan como resultado mol�culas. Si son muchos los �tomos asociados, al resultado le damos el nombre de macromol�culas. La descripci�n de las uniones qu�micas no es suficiente para definir las propiedades de una mol�cula. Dado que los enlaces qu�micos pueden rotar; una peque�a cadena de �tomos puede contorsionarse de diversas maneras en el espacio. Por ejemplo la glucosa podr�a tener dos formas espaciales: una semejante a una silla, y otra parecida a una lanchita. Conforme aumenta el tama�o de las mol�culas, crece el n�mero posible de contorsiones o conformaciones que puede adoptar de manera alarmante. Mediante las t�cnicas de biolog�a estructural hemos podido conocer como est�n conformadas muchas mol�culas, a�os antes de que sea posible predecir o calcular estas conformaciones. En la serie de im�genes que se muestran pueden observarse ejemplos de algunas prote�nas y la forma como se pliegan o conforman en el espacio. N�tense los diversos tama�os y formas que adoptan, y las protuberancias y huecos que presentan. De estas formas tridimensionales depende, primordialmente, la funci�n de estas mol�culas. Las im�genes a, b y c muestran diversas representaciones de una toxina de alacr�n, que permiten visualizar diversos aspectos de su complejidad, las cuales denotan la misma mol�cula, con la misma perspectiva. La imagen d representa a la col�gena, una prote�na fibrosa. La e corresponde al complejo entre un anticuerpo (listones) y el ant�geno reconocido (lisozima; l�neas). La imagen f muestra una enzima constituida por dos subunidades id�nticas, importante en el metabolismo b�sico (triosa fosfato isomerasa) En la imagen g se observa la enzima ß-lactamasa, responsable de la resistencia a la penicilina (esferas), presente en muchas bacterias. Si se observa con cuidado, se notar� que las dos prote�nas mostradas no son id�nticas, pues corresponden a las enzimas de dos bacterias distintas. El antepasado com�n de estas dos prote�nas existi� hace cientos de millones de a�os; la secuencia de las dos prote�nas sólo es id�ntica en 35% de las posiciones y, sin embargo, la estructura permanece altamente conservada por efecto de la selecci�n natural.

LA PREDICCI�N DE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTE�NAS

Hace m�s de dos d�cadas, el investigador dan�s Christian Anfinsen —quien obtuvo el Premio Nobel de qu�mica en 1972— estableci� que la estructura tridimensional de algunas prote�nas est� determinada por su secuencia lineal de amino�cidos. Hoy d�a sabemos que �ste es el caso de la mayor�a de las prote�nas, quiz� de todas. Esta convicci�n hace verdaderamente irresistible el reto de desarrollar m�todos que nos permitan predecir su estructura a partir de la secuencia De entrada dejaremos en claro que �ste es un problema que se considera algo no resuelto. Se ha dicho que el c�digo que relaciona la secuencia con la estructura es como el segundo c�digo gen�tico. Realmente es a trav�s de la estructura tridimensional de las prote�nas, no directamente de su secuencia, que los genes orquestan toda la actividad celular. Este es, pues, uno de los grandes problemas pendientes de la biolog�a moderna.

Quiz� algunos lectores se pregunten: �las poderos�simas computadoras que existen en la actualidad son incapaces de programarse para resolver este problema? El asunto es que este problema tiene variadas e importantes aristas. Por una parte existe un n�mero astron�mico de maneras diferentes de arreglar los �tomos de una prote�na en el espacio. Por la otra, las fuerzas de atracci�n y repulsi�n que determinan que una prote�na se pliegue en el espacio de una manera espec�fica son muy numerosas y con diferencias de magnitud muy sutiles.

Para algunas corrientes, la predicci�n de la estructura de prote�nas no podr� lograrse por muchas d�cadas. Esta visi�n se refiere quiz� a la soluci�n rigurosa del problema. Para otros, algunas de las aproximaciones recientes constituyen avances que permiten prever resultados concretos y pr�cticos en muy corto plazo.

En los �ltimos 5 a�os se han desarrollado t�cnicas muy elaboradas e ingeniosas que permiten extraer y codificar mucha de la informaci�n presente en la base de datos de estructuras tridimensionales conocidas. De aqu� se derivan aproximaciones emp�ricas, que no presuponen que se entiendan finamente las fuerzas que intervienen en el fen�meno de plegamiento. De esta manera, el enfoque m�s promisorio, en la actualidad, tiene como objetivo inicial decidir con cual de las estructuras tridimensionales ya conocidas es compatible la secuencia de una prote�na problema. Lo interesante de la situaci�n es que podemos predecir que existen s�lo alrededor de mil o menos posibles arquitecturas proteicas naturales. Todas las prote�nas existentes se plegar�an en el espacio en alguna de estas arquitecturas. Este es un dato muy interesante si consideramos que en un ser humano se calcula que existen alrededor de 100 mil prote�nas diferentes. La predicci�n mencionada parte de un an�lisis estad�stico de la frecuencia con la que los cristal�grafos y espectroscopistas obtienen estructuras que representan nuevas arquitecturas. Resulta ser que con relativa frecuencia la estructura de una prote�na recientemente resuelta se parece mucho a la de alguna que ya exist�a en la base de datos.

Con la constante refinaci�n y el avance de los m�todos de predicci�n y de las herramientas computacionales que �stos utilizan, esperamos tener una idea aproximada de la estructura espacial de muchas de las prote�nas cuya secuencia aparezca como fruto de la secuenciaci�n del genoma humano, que podr�a completarse dentro de unos 10 a�os (v�ase el cap�tulo IV).

APLICACIONES DE LA INFORMACI�N ESTRUCTURAL

Quiz� muchos lectores coincidan en que el conocimiento de las estructuras que adoptan las biomol�culas constituye un logro espectacular de la ciencia moderna. En cada �poca, los bi�logos estructuralistas han utilizado los �ltimos adelantos tecnol�gicos para avanzar en su trabajo, y as� han ido desentra�ando detalladamente la estructura de mol�culas complej�simas. Cabe preguntarse sin embargo: �de d�nde surge la motivaci�n para dedicar d�cadas enteras a dilucidar determinada estructura molecular? Ciertamente, el placer est�tico de observar la estructura resuelta no parece ser una justificaci�n suficiente para la inversi�n de tiempo y recursos necesarios. La respuesta, que con gran intuici�n destacaron los pioneros de la biolog�a estructural, es que en la estructura detallada de las macromol�culas biol�gicas se encuentran los secretos m�s �ntimos de los fen�menos de la vida.

DISE�O RACIONAL DE DROGAS

Pensemos qu� ocurre cuando ingerimos un medicamento y �ste ejerce su efecto. El medicamento es una sustancia qu�mica que tiene afinidad por alguna de las macromol�culas (generalmente una prote�na) de nuestro organismo. La sustancia medicinal entra al organismo, viaja por medio del torrente sangu�neo, penetra en las c�lulas y finalmente encuentra una mol�cula blanco. La uni�n espec�fica entre estas dos sustancias da como resultado el efecto medicinal. Lo verdaderamente sorprendente es que hasta la fecha no tenemos una idea clara de los detalles de estas interacciones. Como ya hemos se�alado (v�ase el cap�tulo anterior; "El valor de la biodiversidad en el contexto de la biotecnolog�a moderna") casi la totalidad de las medicinas usadas actualmente provienen de principios activos, aislados de plantas, cuya utilidad fue encontrada emp�ricamente, quiz� preservada por la tradici�n de muchos siglos. �Qu� podr�amos esperar, sin embargo, si conocemos la estructura detallada de las mol�culas relevantes para determinada enfermedad? Lo promisorio del conocimiento estructural en este campo es que se puede pensar en dise�ar los medicamentos espec�ficamente para unirse a sus mol�culas blanco. Habr� quien declare que hasta el momento esto se ha podido lograr s�lo en casos excepcionales. Aunque cierto, otros tenemos la convicci�n de que tarde o temprano el dise�o racional de medicamentos ser� la norma y no la excepci�n. De hecho, todas la compa��as farmac�uticas del mundo invierten cuantiosas sumas de dinero en investigaci�n sobre biolog�a estructural y en dise�o de mol�culas por computadora. Aun cuando quiz� estos desarrollos no alcancen a beneficiar a muchos de los enfermos de hoy d�a, el incontenible avance de las t�cnicas empezar� a transformar el ejercicio de la farmacolog�a en un futuro tal vez m�s cercano de lo que imaginamos. Un notable ejemplo entre varios que se desarrollan en la actualidad es la investigaci�n que se realiza para contrarrestar el devastador efecto del virus del SIDA, como se muestra en el recuadro VI. 2.

RECUADRO VI. 2. Estrategias antivirales usando informaci�n estructural Una vez conocido el plegamiento tridimensional de una macromol�cula, se puede pensar en dise�ar sustancias que se le adhieran espec�ficamente, con la intenci�n de inutilizarla. Para el caso del virus del SIDA, hay varias mol�culas que pueden ser blancos interesantes (v�ase el ciclo de vida del virus en el recuadro IV.3). A s�lo 10 a�os de haberse descubierto este virus, ya se conocen las estructuras tridimensionales de dos de sus mol�culas m�s importantes: la proteasa y la transcriptasa reversa. En el caso de esta �ltima, con la participaci�n de un joven investigador mexicano, el doctor Alfredo Jacobo. El reto para el dise�o racional de un f�rmaco contra del SIDA consiste en encontrar sustancias que se unan espec�ficamente al sitio activo de alguna de estas enzimas, inhibiendo as� su funci�n. La informaci�n estructural permite analizar el sitio activo, detectar qu� zonas son importantes para la funci�n, y probar, inicialmente, con m�todos computacionales, cu�les posibles sustancias tendr�an una forma y distribuci�n de cargas complementarias a tales zonas. Algo as� como dise�ar una llave para una cerradura. La otra ventaja de utilizar un esquema racional es que se puede buscar desde el principio una zona en la que sea dif�cil que surja una variante resistente (es decir; que ya no se una o no se inhiba por el f�rmaco), al escoger zonas esenciales para la funci�n de la enzima. El diagrama muestra una vista de la transcriptasa reversa, unida al ADN, y una mol�cula de inhibidores (esferas) asociada en el sitio activo, y fue desarrollado con la colaboraci�n del doctor A. Jacobo. En la actualidad existen varios laboratorios que activamente buscan inhibidores para la proteasa y la transcriptasa reversa. De hecho, las �ltimas noticias consignan pruebas cl�nicas con inhibidores de la proteasa y la transcriptasa reversa para el tratamiento del SIDA. Quiz� en un futuro muy cercano se disponga de tratamientos satisfactorios, tal vez combinando un inhibidor de la proteasa con otro de la transcriptasa reversa.

BIOCAT�LISIS E INGENIER�A DE PROTE�NAS

Otro importante desarrollo relacionado con la estructura de macromol�culas es la biocat�lisis. Consideremos la incre�ble variedad de materiales y procesos que se observan en el mundo viviente. Todav�a no ha sido capaz el hombre de superar las propiedades de fibras como la lana o el algod�n o de fabricar zapatos con materiales que mejoren las cualidades del cuero. Seguimos utilizando perros para detectar cantidades min�sculas de drogas, porque no existe un aparato que tenga tal sensibilidad y capacidad de discriminaci�n. Estos logros son producto de 3 500 millones de a�os de evoluci�n, pero el conocimiento preciso de las propiedades de los sistemas vivos nos permitir�, cada vez m�s, inspirarnos con las formas como la naturaleza ha resuelto los retos de la supervivencia, y aprovechar la infinidad de materiales que ella ofrece para dise�ar productos o procesos espec�ficamente �tiles para las actividades y el bienestar humano.

En particular, la capacidad catal�tica de los sistemas vivos supera con ampl�simo margen la que ha logrado la industria qu�mica. Actualmente los productos qu�micos se producen mediante reacciones que utilizan toda clase de diferentes condiciones de temperatura, presi�n, uso de disolventes, etc. Se purifican con grandes aparatos de destilaci�n, filtraci�n, etc. En contraste, los seres vivos realizan tambi�n toda clase de reacciones qu�micas y producen toda clase de sustancias y materiales, pero siempre a temperaturas moderadas y en soluci�n acuosa. Nuevamente, podemos pensar en utilizar estrategias y materiales similares a los biol�gicos para realizar las transformaciones qu�micas que nos interesan. Aqu� el conocimiento estructural es extremadamente importante. Consideremos que normalmente una enzima est� adaptada para trabajar dentro de una c�lula, sujeta a los requerimientos de regulaci�n y recambio que �sta requiere. Adem�s, efectuar� una reacci�n qu�mica espec�fica, parte del metabolismo celular. En las aplicaciones tecnol�gicas normalmente requeriremos actividades catal�ticas m�s o menos distintas a las naturales. Necesitamos tambi�n enzimas estables y f�ciles de obtener en grandes cantidades. Como fruto del esfuerzo de varias d�cadas se ha logrado "domesticar" cierto numero de enzimas para el servicio del ser humano. Por ejemplo, los detergentes biol�gicos contienen proteasas (enzimas que catalizan la degradaci�n de prote�nas) y lipasas (que degradan grasas), que hace m�s eficiente el lavado. En la industria del refresco se utilizan los jarabes con alto contenido de fructosa que se producen a partir de almid�n, mediante la degradaci�n y conversi�n enzim�tica de dos productos edulcorantes b�sicos: glucosa y fructosa. Inclusive se utilizan procesos de biocat�lisis para la producci�n de compuestos de petroqu�mica secundaria, como el antiespumante acrilamida. Estos logros han sido posibles aun sin la capacidad de cambiar de manera importante la actividad enzim�tica b�sica encontrada en la naturaleza.

Hoy d�a, sin embargo, bas�ndonos en las estructuras tridimensionales de las enzimas, podemos aplicar las t�cnicas del ADN recombinante para modificar significativamente las propiedades de las enzimas, para crear biocatalizadores hechos a la medida. Ha surgido una nueva disciplina: la ingenier�a de prote�nas. Los procedimientos implicados son conceptualmente simples: se a�sla el gene que codifica para la enzima de inter�s; se introducen cambios en su secuencia mediante el uso de ADN sint�tico (v�ase en el cap�tulo II, "El ADN sint�tico"); se sobreproduce la prote�na en alg�n sistema de expresi�n. Claramente, aunque las t�cnicas de ADN recombinante permiten fabricar genes con la secuencia que se nos antoje, se requiere un conocimiento de la estructura tridimensional de la prote�na codificada para poder dise�ar racionalmente los cambios. Precisamente con base en estos conocimientos ha sido posible alterar las propiedades de muchas prote�nas para hacerlas m�s �tiles. Un caso digno de mencionar es la alteraci�n de las propiedades farmacol�gicas de la insulina humana. Como ya mencionamos (cap�tulo V), la producci�n de insulina humana por bacterias fue uno de los primeros logros de la ingenier�a gen�tica. La utilidad de esta hormona es limitada, sin embargo, porque al no producirse de manera continua por las c�lulas del p�ncreas, dentro del propio organismo, su disoluci�n y concentraci�n en la sangre no sigue los patrones m�s adecuados. Se requiere disminuir la tendencia que tiene la mol�cula natural a agregarse entre s�. Con base en el conocimiento de la estructura tridimensional de la insulina (determinada hace varias d�cadas) fue posible dise�ar cambios que se localizan precisamente en la interfase entre las dos mol�culas que se agregan, y que, al alterar su carga el�ctrica, las hace repelerse, haci�ndolas m�s solubles. Otros muchos ejemplos atestiguan la creciente capacidad de cambiar los atributos de las prote�nas mediante el dise�o racional.

EVOLUCI�N DIRIGIDA O DISE�O "IRRACIONAL" DE MOL�CULAS

La ingenier�a de prote�nas, sin embargo, no est� condicionada totalmente al avance de nuestros conocimientos. En este momento se desarrollan tambi�n enfoques muy interesantes para llegar m�s lejos que lo que nuestro conocimiento permitir�a. Sabemos que la evoluci�n ha producido seres de pasmosa complejidad, por medio de un proceso ciego de variaci�n y selecci�n. �Qu� pasar�a si pudi�ramos simular estos procesos evolutivos, s�lo que en tiempos mucho m�s cortos? Una vez m�s, el ADN recombinante permite realizar experimentos antes imposibles. Utilizando ADN sint�tico y enzimas que lo reproducen (v�ase en este cap�tulo, "La predicci�n de la estructura de las prote�nas"), podemos generar numeros�simos conjuntos de mol�culas diferentes.

Figura VI. 1 (v�ase más adelante)

Al explicar los conceptos de la evoluci�n molecular dirigida tengo la oportunidad (y perd�neme el lector que la aproveche) de explicar el trabajo que realizamos en mi laboratorio del Instituto de Biotecnolog�a. Desde que tuve la oportunidad de viajar a Estados Unidos para especializarme en las t�cnicas de s�ntesis qu�mica de oligonucle�tidos me llam� poderosamente la atenci�n que los oligos pod�an utilizarse para alterar espec�ficamente genes particulares. M�s adelante decid� especializarme en utilizar estas t�cnicas para realizar mutag�nesis a saturaci�n y mutag�nesis combinatoria. Estos conceptos se refieren al proceso de generar variabilidad dentro de un gene. Pero veamos con m�s detenimiento de qu� se trata.

En un procedimiento tradicional de mutag�nesis dirigida por oligonucle�tidos (v�ase el recuadro II.4. El ADN sint�tico y sus aplicaciones) se introduce un cambio predeterminado, codificado en la secuencia del oligo, al gene objetivo. �Qu� pasar�a, sin embargo, si un esquema similar se utilizara pero con una multitud de oligonucle�tidos, cada uno con una secuencia un poco diferente? La respuesta es que obtendr�amos un conjunto de mol�culas variantes en la zona afectada por el oligo. Es importante darse cuenta de que cuando hablamos de la obtenci�n de "un oligo", o de la donaci�n de "un" segmento de ADN en "un" vector de donaci�n, en realidad hablamos de manipular trillones de mol�culas simult�neamente, todas ellas iguales. Pero podemos hacer que estas mol�culas no sean exactamente iguales. Pensemos que al sintetizar un oligo, en una determinada posici�n no adicionamos s�lo la base correspondiente a la secuencia natural, sino que ponemos una mezcla de las cuatro bases. Supongamos que el oligo llevaba ya adicionadas unas 15 bases, con una secuencia determinada. A partir de la base 16, las cadenas de oligo que van creciendo en la resma de s�ntesis ya no son todas iguales. Ahora tenemos cuatro tipos: todos los oligos son iguales en sus primeras 15 bases, pero hay unos que contienen A, otros G, otros C y otros T, en la posici�n 16. Tenemos cuatro tipos de oligos. Si repetimos este procedimiento, los oligos resultantes ser�n de 16 clases distintas, cuatro que ya exist�an, multiplicadas por cuatro nuevas posibilidades. La continuaci�n de este proceso genera toda una serie de combinaciones de secuencias en la regi�n donde se adicionan las cuatro bases. Despu�s, se puede regresar al r�gimen anterior; y adicionar bases �nicas en secuencia definida. Obtendr�amos as�, adheridos a la resma de s�ntesis, desde unos cuantos hasta trillones o m�s de oligonucle�tidos, todos con extremos iguales, pero que en el centro son diferentes. Al incorporar oligos de esta mezcla (llamados oligos degenerados) en un protocolo de mutag�nesis dirigida (v�ase nuevamente el recuadro II.4), obtendr�amos desde unos cuantos hasta trillones de diferentes genes variantes, que luego podemos introducir a las c�lulas para su expresión.

Existen distintas maneras de inducir variabilidad en mol�culas de �cidos nucleicos, pero todas tienen en com�n los mismos elementos. Una vez obtenida una variante, su replicaci�n perpet�a el cambio inducido. La expresi�n del gene, dentro de una c�lula, produce una prote�na distinta para cada variante, de acuerdo con el c�digo gen�tico. Resulta as� que la manipulaci�n de �cidos nucleicos ofrece un mecanismo relativamente simple (infinitamente m�s simple que el de la s�ntesis org�nica directa) para crear innumerables mol�culas distintas. El siguiente paso, tal y como nos lo ha indicado la evoluci�n natural, consiste en dise�ar un m�todo de selecci�n. Hay que detectar e identificar cu�l de los genes variantes dio origen a una prote�na con una actividad interesante. Para ejemplificar c�mo se puede lograr; citar� un caso ocurrido en mi laboratorio.

Estamos interesados en explorar la relaci�n entre la estructura y la funci�n de una enzima llamada ß-lactamasa, que producen diversas bacterias para defenderse de la penicilina. La ß-lactamasa nos llam� la atenci�n en cuanto se public� su estructura tridimensional (obtenida por cristalograf�a de rayos X). Lo atractivo de esta enzima es que su actividad consiste en degradar la penicilina y, al hacerlo permite que una bacteria que expresa ß-lactamasa pueda vivir en presencia de este antibi�tico (note el lector que es precisamente el gene que codifica para ß-lactamasa el que se utiliza abundantemente en los vectores de donaci�n bacteriana, ya que permite detectar las c�lulas que han adquirido el pl�smido; v�ase el recuadro II.2. Los procedimientos b�sicos del ADN recombinante). Esto quiere decir que tenemos disponible de inmediato un m�todo de selecci�n.

�Qu� preguntas podemos responder aplicando los conceptos de variaci�n y selecci�n mencionados antes sobre la ß-lactamasa? Hemos enfocado nuestros experimentos en el problema de la especificidad de esta enzima. La ß-lactamasa con la que trabajamos es capaz de reconocer y destruir penicilinas, pero no cefalosporinas, que son compuestos muy similares. �En qu� parte y de qu� manera determina la secuencia de amino�cidos de la ß-lactamasa el que sea espec�fica para penicilinas? Para responder esta pregunta utilizamos la informaci�n proporcionada por la estructura cristalogr�fica. Observamos que en el sitio activo se encuentra una serie de amino�cidos que interaccionan con la penicilina (v�ase la figura VI. 1). Una vez identificados estos amino�cidos potencialmente involucrados en el reconocimiento de la penicilina, dise�amos experimentos para introducir variabilidad en la posici�n que ocupan �stos dentro de la enzima. Mediante oligos degenerados, como los descritos anteriormente, generamos millones de diferentes genes de ß-lactamasas, que difieren entre s� en alguno o algunos de los tripletes de bases que corresponden a los amino�cidos seleccionados. A partir de una biblioteca de clonas con esta colecci�n de genes, podemos identificar una bacteria que ahora crezca en la cefalosporina, debido a que la ß-lactamasa ya la puede reconocer.

Hasta el momento, en el laboratorio hemos encontrado un buen n�mero de ß-lactamasas variantes que reconocen diversos antibi�ticos. Con los datos obtenidos hemos aprendido mucho acerca de la relaci�n entre la estructura y la funci�n de estas enzimas. Adicionalmente, contamos con un m�todo experimental para evaluar para qu� antibi�ticos, de tipo de las penicilinas y cefalosporinas, es m�s dif�cil obtener una ß-lactamasa que los destruya. Esta informaci�n puede ser de utilidad para las compa��as farmac�uticas que desarrollan estos antibi�ticos.

La extensi�n natural de este tipo de investigaci�n es la obtenci�n de nuevas enzimas cuyas actividades y especificidades se adapten a las necesidades humanas. En particular, esquemas como el que estamos desarrollando pueden ser adaptados para la obtenci�n de biocatalizadores, que tienen un gran potencial en la industria de la qu�mica fina (incluida la industria farmac�utica).

La explotaci�n de los m�todos de generaci�n de variabilidad, mediante el uso de ADN recombinante, augura un futuro muy promisorio para obtener mol�culas hechas a la medida. Se puede decir que en los �ltimos cinco a�os, usando estos m�todos, se han explorado las propiedades de m�s compuestos que en toda la historia.