IV. LAS REVELACIONES DE LA MOL�CULA MAESTRA
Consecuencias de la revoluci�n metodol�gica en la adquisici�n de conocimiento.
EN LAS secciones anteriores he intentado proveer al lector de
un marco conceptual adecuado para comprender de una manera m�s precisa las m�ltiples
aplicaciones del ADN recombinante. Quiz� con el material proporcionado
hasta el momento se pueda tener una noci�n de la potencialidad extraordinaria
de esta metodolog�a. Este cap�tulo y el siguiente estar�n orientados a describir
algunas de las �reas en las que las aplicaciones del ADN recombinante
han tenido influencia. Tratar� de concentrarme en aquellas que resultan m�s
evidentes, interesantes o potencialmente importantes por su magnitud en nuestra
concepci�n del mundo o en nuestra forma de vida. Quisiera hacer incap�e en que
esta relaci�n de aplicaciones es, por necesidad, extremadamente limitada: la
ingenier�a gen�tica ha influido virtualmente en todo el espectro de la investigaci�n
biológica experimental.
Recuerdo haber leido una aseveraci�n hecha por un cient�fico unos pocos a�os despu�s de que se iniciara la epidemia mundial del SIDA, quien afirmaba que si esta enfermedad hubiera hecho su aparici�n antes del surgimiento del ADN recombinante, seguir�amos buscando su causa debajo de las piedras.
A riesgo de ser repetitivo, quisiera tambi�n hacer comentarios acerca de mi perspectiva personal sobre la importancia del ADN recombinante. Mi experiencia en el campo de la investigaci�n cient�fica se inici� a finales de la d�cada de los setenta. En esos a�os la ingenier�a gen�tica estaba en su infancia, y se empezaba a establecer en el Instituto de Investigaciones Biom�d�cas de la UNAM. Cuando reparo en una serie de aspectos relativos al quehacer cient�fico tal como eran hace 15 a�os, y los comparo con la situaci�n actual, no ceso de sorprenderme. Cuando reviso (como una de mis actividades semanales) el c�mulo de conocimientos que aparece en la literatura cient�fica, �sta es comparable a un verdadero alud. Los resultados que se reportan en un solo art�culo habr�an requerido de varios a�os de trabajo hace una d�cada. Me parece que un c�lculo conservador podr�a indicar que la velocidad a la que se pueden desarrollar nuevos conocimientos en biolog�a experimental es unas 10 veces mayor de la requerida en el momento que inici� mi trabajo como cient�fico. Estamos en un punto en el que quiz� la limitante empieza a ser la capacidad de la comunidad cient�fica para asimilar e integrar los conocimientos generados. Es posible, tambi�n, que estemos cercanos al punto en el que la velocidad de crecimiento en la acumulaci�n de conocimientos empiece a disminuir por razones econ�micas: �se requerir� destinar una proporci�n excesiva de recursos humanos y materiales para sostener el paso que llevamos actualmente!
Tomemos algunas muestras de los avances que hago menci�n.
El inicio del estudio sobre la naturaleza de los genes se ocurre, naturalmente, en algunos de los organismos m�s simples como las bacterias. En t�rminos generales, el estudio de todo tipo de microorganismos se ha convertido en una actividad con m�ltiples facetas. La experimentaci�n tiene hoy, gracias al ADN recombinante, dimensiones completamente nuevas.
Una vez aislado e identificado un gene, podemos alterarlo y reintroducirlo a la c�lula bacteriana para observar las consecuencias de la alteraci�n. Desde los albores de esa era de la ingenier�a gen�tica, al final de los a�os setenta, se empezaron a acumular datos acerca de genes microbianos, y la estructura y funci�n del gene se fue clarificando y cobrando detalles (recuadro lV.I).
Por ejemplo, para ilustrar el an�lisis de la regulaci�n de un gene, tomemos un experimento simple. Supongamos que queremos saber en qu� condiciones se activa la expresi�n de un conjunto de genes que participan en la respuesta al calor de una bacteria. Estos genes pueden formar parte de un complejo circuito, y ser�a dif�cil seguir la actividad de cada uno por medio de su funci�n natural. En cambio, lo que podemos hacer gracias al ADN recombinante es construir un gene mixto por cada gene que deseamos estudiar asociando a la regi�n regulatoria otro gene estructural que s� sea f�cil de seguir. Esto es lo que llamamos un gene reportero. Por ejemplo, podemos usar un gene que codifique para una enzima que act�e en un sustrato sin color y que al combinarse lo convierta en un producto colorido. De hecho actualmente se dispone de varios genes reporteros con las caracter�sticas antes descritas. El gene de la ß-galactosidasa, uno de los genes caracterizados en las �pocas pioneras de la biolog�a molecular; ha sido utilizado con este prop�sito. (Curiosamente esta misma enzima, la ß-galactosidasa, es responsable de que los seres humanos digiramos la lactosa de la leche, y al desactivarse su expresi�n, en muchos adultos se desarrolle la intolerancia a la leche.) Pues bien, si introducimos a la c�lula bacteriana un gene quim�rico o mixto, cuya regi�n regulatoria est� relacionada con la respuesta al calor, y la regi�n estructural codifica para la ß-galactosidasa, observaremos la respuesta que normalmente tendr�a el gene de inter�s, simplemente advirtiendo el cambio de color de las colonias transformadas.
Por medio de estudios en los que se alteran varias partes de los genes y se prueban en diversas condiciones, existe hoy d�a una idea extremadamente elaborada acerca de las formas como se regulan los genes que intervienen en todo tipo de procesos. Sin embargo, distamos mucho de haber comprendido satisfactoriamente, incluso los procesos de regulaci�n m�s simples.
INMUNOLOG�A Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Algunos de los fen�menos biol�gicos que resultan m�s familiares son los que se manifiestan en el curso de las enfermedades infecciosas. En este tipo de situaciones se observan interacciones entre el agente infeccioso y el enfermo que se han podido comprender bien en el nivel molecular. La descripci�n de algunos aspectos b�sicos sobre el funcionamiento del sistema inmunol�gico, as� como de lo que entendemos acerca de ciertos mecanismos de patogenicidad puede ilustrar muy bien el papel que desempe�an las mol�culas biol�gicas en ellos y c�mo se ha podido enfocar su estudio mediante el uso del ADN recombinante.
Los anticuerpos y c�mo se producen
Cuando una sustancia extra�a invade el organismo se desencadena una serie de reacciones de defensa, fundamentalmente para establecer que esa sustancia no es propia. Uno de los principales componentes de este sistema lo constituyen los anticuerpos, que se unen y "marcan" la sustancia extra�a para su posterior destrucci�n. Estas sustancias son (quiz� el lector lo recuerde) prote�nas. Los anticuerpos llamaron la atenci�n de los cient�ficos desde hace muchas d�cadas. El acceso a ellas hab�a sido relativamente f�cil, dado que son abundantes en la sangre. Los primeros experimentos de separaci�n de los componentes de la sangre revelaban varias manchas numerosas en el patr�n electrofor�tico (v�ase en el cap�tulo 1, "Separaci�n y an�lisis de las prote�nas", ), las cuales se denominaron globulinas. Una de ellas, la que correspond�a a lo que se llam� a-globulinas, agrupaba los anticuerpos hoy nombrados inmuno-globulinas G. Muy pronto, despu�s de que se identific� que estas sustancias eran los anticuerpos, los inmun�logos se preguntaban c�mo era posible que el organismo fuera capaz de generar tal multitud de prote�nas, como para ser capaces de reconocer cualquier sustancia extra�a que nos invadiera. M�s a�n, ciertas c�lulas cancerosas, llamadas mielomas, se pueden obtener en gran cantidad, y su an�lisis revel� que cada una de ellas produc�a uno, y s�lo un tipo de anticuerpo. Por el dogma central de la biolog�a molecular se infer�a que cada anticuerpo era el producto de un gene y esto hac�a surgir una paradoja: dados los millones de anticuerpos diferentes que se sab�a que exist�an en un organismo dado, �los genes que codifican para ellos deber�an ocupar todo el genoma del organismo! Diversas hip�tesis fueron avanzadas para explicar lo que suced�a. Como es frecuente, hubo alguien que intuy� la respuesta correcta: los inmun�logos Dreyer y Benett propusieron una osada hip�tesis en 1965. Dado que se sab�a que los diversos anticuerpos eran muy parecidos entre s� y s�lo difer�an en una peque�a parte de su secuencia, ellos pensaron que lo que podr�a estar ocurriendo es que existiera s�lo un gene para la parte constante y muchos genes para las peque�as partes variables. Esta hip�tesis significa que el genoma tendr�a que rearreglarse para poder generar los genes maduros, que codificar�an para el anticuerpo particular que una c�lula dada expresaba. Esta hip�tesis fue muy mal recibida porque se pensaba que el arreglo del genoma era muy estable.
La respuesta a esta interrogante s�lo surgi� una vez que se dispuso de las
t�cnicas de ADN recombinante. Entonces fue posible realizar una
serie de experimentos, que le hicieron ganar a Susumu Tonegawa el Premio Nobel
de fisiolog�a o medicina otorgado en 1987, en los que se demostr� el funcionamiento
de uno de los procesos m�s complejos de la evoluci�n biol�gica. En su demostraci�n,
Tonegawa y sus colaboradores utilizaron la propiedad de hibridizaci�n de �cidos
nucleicos para mostrar que el ARN mensajero purificado de un mieloma
es capaz de asociarse a un solo pedazo de ADN obtenido del mieloma,
pero se une a dos pedazos de ADN proveniente de cualquier otra
c�lula. En efecto, el ADN estaba realizando un reacomodo para los
genes de las inmunoglobulinas. El trabajo sucesivo de Tonegawa, y muchos otros
investigadores, estableci� lo que hoy conocemos con bastante precisi�n respecto
a la bios�ntesis de los anticuerpos (v�ase el recuadro IV.2). En este proceso
el organismo genera un variad�simo repertorio de anticuerpos, a ciegas, de una
manera muy eficiente, para despu�s hacer proliferar s�lo a las c�lulas que son
capaces de manufacturar el anticuerpo �til en un momento dado, es decir, cuando
se presenta el ant�geno, o sustancia extra�a.
En los �ltimos 15 a�os se ha acumulado una enorme cantidad de informaci�n acerca del funcionamiento del sistema inmunol�gico. No s�lo conocemos la secuencia de amino�cidos de miles de diferentes anticuerpos y de sus genes, sino que se han identificado un sinn�mero de factores adicionales que modulan la compleja serie de interacciones que ocurre en una respuesta inmune. Este conocimiento ha servido como base para el uso de anticuerpos en la terap�utica del futuro inmediato, as� como para crear una base firme en el dise�o de nuevas vacunas (v�ase el cap�tulo siguiente).
Estudio de agentes infecciosos
Qui�n no recuerda haber o�do hablar de las �pocas pioneras en que Luis Pasteur y los otros cazadores de microbios rompieron moldes demostrando la existencia de microorganismos, que eran los responsables de la putrefacci�n y de muchas enfermedades. Efectivamente, la microbiolog�a es un gran pilar de la investigaci�n biol�gica experimental, y como ya mencionamos, sent� incluso las bases de la gen�tica molecular. El avance de estas investigaciones, sin embargo, no escap� a los l�mites de la metodolog�a disponible, encontr�ndose con obst�culos dif�ciles de sortear hasta el surgimiento del ADN recombinante.
Pensemos, por ejemplo, en lo complicado que resulta trabajar con una bacteria o un virus pat�geno. Se requiere cultivarlo en grandes cantidades, lo que entra�a un gran riesgo para el experimentador. Adem�s, muchos organismos pat�genos s�lo se reproducen en condiciones muy especiales, como en el interior de su organismo hospedero. La posibilidad de donar sus genes abre, sin embargo, innumerables de posibilidades.
Los agentes infecciosos est�n siendo estudiados activamente desde diversos �ngulos. Los genes responsables de la patogenicidad de muchas bacterias han sido aislados y secuenciados; se han podido comparar los genes de cepas pat�genas con los de cepas no pat�genas; se han identificado, a nivel fino, los componentes de la superficie de agentes infecciosos que les permiten evadir la respuesta inmune... En fin, la lista podr�a seguir por varias p�ginas.
Tomemos, por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que produce el SIDA. El cual s�lo se encuentra en ciertas c�lulas de la sangre: una clase particular de linfocitos (gl�bulos blancos) del tipo T. De un enfermo s�lo se pueden aislar cantidades min�sculas del virus. Sin embargo, gracias a la ingenier�a gen�tica, a s�lo unos pocos a�os de haber sido identificada la enfermedad, se han hecho grandes avances. La inmensa mayor�a de los estudios que se han realizado alrededor de este virus emplean ADN recombinante, y han generado un vasto conjunto de conocimientos, que han permitido su diagn�stico y sentado las bases para lograr su prevenci�n y tratamiento. Aun cuando dicho tratamiento no es todav�a una realidad, todo parece indicar que el control de esta enfermedad se lograr� en un tiempo r�cord, particularmente si se toma en cuenta lo incre�blemente dif�cil de conocer y atacar, y lo elusivo que resulta ser el virus que la causa.
Espec�ficamente, a pesar de que el virus del SIDA s�lo se encuentra
en peque�as cantidades dentro de las c�lulas de enfermos humanos (es decir que
no se puede cultivar), desde hace varios a�os se conoce la secuencia completa
de su genoma de 9200 bases. Asimismo, se han identificado todos y cada uno de
lo genes que lo constituyen y les han asignado funciones a la mayor�a de ellos.
Su ciclo de vida ha sido disecado en sus aspectos fundamentales, haciendo referencia
a otros virus similares (de la familia de los retrovirus, que pueden causar
c�ncer). Se conoce c�mo el virus, despu�s de introducirse a las c�lulas, copia
su genoma de ARN lo convierte en ADN, y lo incorpora
o integra al ADN de la c�lula humana. Desde ah� expresa sus genes,
de lo que resulta la producci�n de m�s virus y su salida de la c�lula, listos
para atacar otras c�lulas (v�ase el recuadro IV.3).
La utilidad de este tipo de conocimientos para lograr el control del SIDA
y de otras enfermedades se ilustrar� al abordar la aplicaci�n de la biotecnolog�a
en el campo de la salud, en el cap�tulo siguiente y, nuevamente, en el VI.
ESTUDIOS SOBRE LAS CAUSAS DEL C�NCER
Todos sabemos sobre la gran cantidad de recursos materiales y humanos que se han invertido en la incesante b�squeda de la humanidad para conocer las causas, la naturaleza y la forma de curar el c�ncer. Aunque estos estudios han ido produciendo conocimientos �tiles, la mayor�a de lo que sabemos actualmente sobre c�ncer proviene de estudios relativamente recientes, que emplean ADN recombinante.
Hay que destacar que cuando nos referimos al c�ncer, hablamos de fen�menos patol�gicos que tienen algo en com�n: la proliferaci�n descontrolada de cierto grupo de c�lulas del organismo, pero quiz� no es tan claro para nosotros que hay muchas causas y condicionamientos que pueden desembocar en la aparici�n del c�ncer. Existen factores del ambiente, factores gen�ticos y hasta infecciosos relacionados con muchos tipos de c�ncer. En el fondo, el c�ncer es una enfermedad gen�tica. Algo ocurre al programa gen�tico de una c�lula y �sta no responde m�s al control normal y se divide continuamente, generando su progenie, la cual hereda la cualidad de dividirse descontroladamente. La lesi�n debe haber ocurrido en el genoma, y por ello se transmite a las c�lulas descendientes. Durante d�cadas se ha estudiado incesantemente esta enfermedad. Ya en 1911 Peyton Rous describ�a que el c�ncer se pod�a trasplantar de un pollo enfermo a otro, lo que eventualmente se pudo atribuir a un virus causal.
Como se dijo ya, en el estudio del c�ncer, el ADN recombinante ha tenido un impacto generalizado y definitivo. Hemos aprendido m�s al respecto del c�ncer en los �ltimos 15 a�os que en todas las d�cadas anteriores, en las que tambi�n hubo intensa investigaci�n. En este proceso de conocimiento ha sido crucial la identificaci�n de genes espec�ficos causantes del c�ncer, denominados oncogenes, inicialmente identificados dentro de los virus cancer�genos. Si reflexionamos un momento, lo realmente asombroso es que nuestro organismo tal vez sea un sistema capaz de controlar de manera exquisita la proliferaci�n de gran diversidad de tipos celulares. Evidentemente debe haber genes cuya actividad promueva la proliferaci�n de las c�lulas, y que cesan de actuar en un momento determinado, de acuerdo con un programa preestablecido. Quiz� uno de los aspectos m�s interesantes de la investigaci�n del c�ncer es que nos ha acercado al conocimiento �ntimo de los mecanismos de regulaci�n de la proliferaci�n celular. Resulta ser que muchos oncogenes no son m�s que versiones alteradas de genes esenciales, naturalmente presentes en todas nuestras c�lulas. Estos genes son ahora identificados como protooncogenes.
Hasta el momento existen por lo menos cuatro tipos muy bien definidos de oncogenes:
unos participan en la recepci�n de se�ales externas de proliferaci�n, cuyos
productos se localizan en la membrana de las c�lulas; otros codifican, en s�
mismos, para se�ales de proliferaci�n, que son secretadas al medio extracelular;
otros m�s intervienen en la interpretaci�n o transducci�n de la se�al de proliferaci�n;
finalmente, encontramos genes cuyos productos interaccionan espec�ficamente
con el ADN, causando la expresi�n de genes que, a su vez, inducen
la proliferaci�n celular.
�C�mo es que estos genes se transforman de protooncogenes a oncogenes? Es f�cil entender los mecanismos, despu�s de que la clonaci�n de los genes y su secuenciaci�n ha revelado las lesiones responsables. (Para explicar algunos de los fen�menos bien caracterizados sobre el c�ncer, es importante que el lector tenga presente la descripci�n un poco m�s precisa de lo que es un gene en el recuadro IV.1).
Un protooncogene puede ser activado al insertarse un virus cerca de su regi�n
regulatoria.2![[Nota 1]](../img/mcommnt.gif){kind=small}
El gene se expresa ahora de acuerdo con el programa del virus, y no con el programa
natural de la c�lula. Otra manera de activarse es cuando la lesi�n resulta de
anormalidades cromos�micas. Nuevamente, los rearreglos tienen como consecuencia
en la asociaci�n del oncogene a nuevas regiones regulatorias.
Por ejemplo, se ha observado la transformaci�n de oncogenes por una sola mutaci�n, o mutaci�n puntual. Puede ocurrir que la alteraci�n de un solo nucle�tido y la consecuente alteraci�n de un solo amino�cido, resulte en que la prote�na correspondiente muestre una actividad alterada que la saca de control. Ciertos oncogenes resultan de un fen�meno de este tipo. !Ocurre entonces, que en ciertas circunstancias, una alteraci�n en uno de los 3 mil millones de pares de bases del genoma humano resulta en la aparici�n de c�ncer!
Es importante destacar, sin embargo, que aunque se conozcan muchas de las causas moleculares que pueden desembocar en c�ncer, y se hayan identificado los genes respectivos, el panorama es, en realidad, mucho m�s complejo. La interacci�n de otros genes, los antioncogenes, regula y modera la actividad de los oncogenes. El sistema inmunol�gico es capaz de destruir espec�ficamente c�lulas cancerosas, eliminando quiz� gran cantidad de brotes de c�ncer que se producen espont�neamente en todos los individuos. Es, pues, por la interacci�n de todos estos factores, causativos, antag�nicos y moduladores, que ocurre el desenlace final de la aparici�n o no de la enfermedad. Claramente, cualquier factor ambiental o infeccioso que cause mutaciones, puede, en principio, propiciar la aparici�n de c�ncer. La susceptibilidad del individuo, medida por la eficacia de su sistema inmune y la particular actividad de mecanismos de control, determinar� la frecuencia con la que las lesiones gen�ticas producen la enfermedad, o son contrarrestadas.
Entre los descubrimientos m�s recientes se encuentran ante oncogenes que est�n muy frecuentemente asociados a ciertos tipos de c�ncer. Uno de ellos codifica para la prote�na denominada p53, la cual fue seleccionada mol�cula del a�o en 1993 por la revista Science. Como su nombre lo indica (una denominaci�n como p53 responde t�picamente a una proteína de actividad desconocida, pero de peso molecular de alrededor de 53 mil), esta prote�na no se consider� muy importante durante una d�cada despu�s de su descubrimiento. Hoy d�a sabemos que el gene que codifica para esta prote�na se encuentra mutado en hasta el 50% o m�s de los pacientes con ciertos tipos de c�ncer.
Evidentemente, el acervo de conocimientos que se ha ido acumulando permite la apertura de m�s y m�s avenidas nuevas para el tratamiento del c�ncer (v�ase el cap�tulo siguiente).
El reto de entender los fen�menos biol�gicos a nivel molecular de ninguna manera se circunscribe a las funciones celulares. El reto m�s formidable es desenterrar los fen�menos integradores que nos permiten interaccionar con nuestro ambiente, percibirlo y transformarlo. La evoluci�n biol�gica produjo, en un periodo de 3 ó 4 mil millones de a�os, seres vivos de enorme complejidad, capaces de reaccionar ante el ambiente de maneras verdaderamente complejas. Muchos de los fen�menos que hasta ahora hemos descrito son comunes a todos los seres vivos, pero otros ata�en s�lo a las formas de vida m�s complejas. En el ser humano se conjugaron factores biol�gicos que han dado paso a una nueva y reciente etapa de la evoluci�n: la cultural. En los �ltimos 50 o 100 mil a�os, las comunidades humanas se han embarcado en la preservaci�n y transmisi�n de informaci�n, que ha desembocado en una total transformaci�n de sus actividades y de su capacidad para impresionar al resto de la naturaleza. Los sistemas biol�gicos que subyacen esta portentosa capacidad son objetos de intensa curiosidad para los cient�ficos. No es de extra�arse entonces que, en la actualidad, una proporci�n significativa de los bi�logos experimentales est�n dedicados al estudio de los sistemas nervioso y endocrino.
El estudio de la funci�n neuronal a nivel molecular ha revelado la importancia de varios tipos de prote�nas. Es importante destacar el papel primordial de los canales i�nicos, que participan en gran n�mero de los procesos de todas las c�lulas y su comunicaci�n con el exterior. La comunicaci�n del impulso nervioso depende, precisamente, de la existencia de canales que permiten el flujo de iones, es decir, �tomos o mol�culas con carga electroqu�mica, en ciertas condiciones. Los canales i�nicos se encuentran en las membranas de las c�lulas, al igual que otras prote�nas que reciben el nombre de receptores. De la interacci�n de receptores con mol�culas mensajeras dependen numerosas transacciones biol�gicas. En otras palabras, en la superficie de las c�lulas se desarrollan una infinidad de interacciones y transacciones moleculares, mediadas por receptores y canales, que dan como resultado la respuesta de las c�lulas a los est�mulos exteriores. En el estudio del sistema nervioso, los canales y los receptores tienen un papel protag�nico (v�ase la figura IV.1)
En este campo, tambi�n adquiere especial relevancia la utilizaci�n de sistemas modelo. Sabemos que muchos de los experimentos cl�sicos de neurobiolog�a se hicieron con gatos, como animales de experimentaci�n. Sin embargo, a nivel molecular; el organismo modelo que ha probado ser m�s valioso es la mosca de la fruta, Drosophila sp.
Debido a la gran cantidad de estudios gen�ticos previamente realizados en esta especie, ha sido factible aislar moscas mutantes con deficiencia en alguno de los procesos relacionados con la funci�n nerviosa, y despu�s localizar e identificar los genes responsables de dichas funciones. Quiz� nos intrigue c�mo es posible obtener moscas mutantes en genes que intervienen en el sistema nervioso. Adem�s, podr�amos preguntarnos: �que tienen que ver los genes del sistema nervioso de la mosca con los de un ser humano?
La capacidad de aislar mutantes de genes que participan en procesos espec�ficos es una de las herramientas m�s poderosas de la biolog�a experimental. En el caso de Drosophila podemos ver la aplicaci�n de los m�todos m�s simples e ingeniosos, producto de muchas d�cadas de tradici�n en su estudio. Se han aislado genes del sistema nervioso utilizando desde las t�cnicas m�s cl�sicas hasta las m�s complejas y modernas, producto del conocimiento de biolog�a molecular.
Un ejemplo interesante es el aislamiento de genes relacionados con los procesos
de la memoria. Para este prop�sito se dise�a un experimento muy simple (v�ase
la figura IV.2). Un conjunto de moscas se introduce en un peque�o recipiente
que contiene una sustancia arom�tica. Despu�s se retira el aromatizante y se
aplica otra sustancia de aroma diferente, s�lo que esta vez acompa�ada de un
choque el�ctrico. Si las moscas han aprendido a asociar el desagradable choque
el�ctrico con un aromatizante y no con el otro, entonces deber�n alejarse del
primero. Esto es precisamente lo que se observa al colocar a las moscas en una
c�mara central conectada a dos c�maras con aromatizante. Las moscas se dirigen
preferentemente a la c�mara del olor que no asocian con los choques el�ctricos.
Este experimento se puede hacer ahora con moscas previamente sujetas a un tratamiento
mut�geno (por ejemplo, con un tratamiento qu�mico suave de los huevecillos).
Entre las moscas as� tratadas puede haber mutantes de muchos tipos, pero algunas
podr�an tener alterados los procesos de memoria. Y, en efecto, en el experimento
de las tres c�maras conectadas, se pueden identificar moscas que ya no son capaces
de recordar que un olor se asocia a un choque el�ctrico, y se distribuyen por
igual a lo largo de las c�maras. Otras, por ejemplo, se pueden acordar de la
asociaci�n olor-choque el�ctrico por un corto periodo, pero luego lo olvidan,
m�s r�pido que las moscas normales. Experimentos parecidos a �stos se han podido
hacer desde hace muchas d�cadas y, de hecho, una gran colecci�n de miles de
mutantes de todo tipo, est� disponible en Drosophila. Lo interesante
es que a partir del ADN recombinante, ahora ya podemos saber qu�
genes est�n alterados y obtener su secuencia.
|
Lo anterior nos conduce a la segunda pregunta: �qu� relaci�n tienen estos genes mutantes con el sistema nervioso humano? El an�lisis de los genes mutantes mencionados revel� que las alteraciones se encuentran en prote�nas que participan en la se�alizaci�n celular, muchas de ellas se conservan en todo el mundo eucarionte, desde las levaduras hasta los humanos, como por ejemplo la enzima adenilato ciclasa, cuya alteraci�n es responsable de uno de los fenotipos de p�rdida de memoria en Drosophila. En las c�lulas nerviosas de mam�feros (por supuesto incluyendo a los seres humanos), tambi�n hay adenilato ciclasa. Es altamente probable que la funci�n de la adenilato ciclasa interviene asimismo en los procesos moleculares que subyacen en la memoria de los seres humanos. �Quiz� a la memoria de corto plazo?
Al observar hallazgos tan interesantes como �stos, suena l�gico pensar en c�mo seguir avanzando para averiguar m�s acerca del fen�meno y contrastar hip�tesis. Una de las formas m�s poderosas para experimentar con organismos superiores es reintroducir en ellos genes alterados, de manera muy similar a los genes bacterianos (v�ase en este cap�tulo, "Estructura y funci�n del gene").
Un organismo al que artificialmente se le han introducido genes ex�genos se
conoce como organismo transg�nico. La t�cnica para producir organismos superiores
transg�nicos usando ADN recombinante se introdujo a principios
de los a�os ochenta, inicialmente utilizando ratones en los que la embriolog�a
estaba muy desarrollada (recuadro IV.4). Hoy en d�a se pueden producir diversos
animales y plantas transg�nicas, entre los que se encuentra Drosophila.
Con todos los genes disponibles de esta mosca, y la posibilidad de manipularlos
e introducirlos nuevamente al organismo completo, el panorama para el experimentador
es verdaderamente atractivo. Incluso se dispone de m�todos tan ingenuos como
el de la coloraci�n, mencionado anteriormente (v�ase en este cap�tulo, "Estructura
y funci�n del gene", p 69). En la mosca de la fruta se dispone del gene rosy,
que es b�sicamente inocuo, pero produce moscas con ojos rosa, en vez de rojos,
y que permite distinguir una mosca transg�nica entre muchas otras que no lo
son, por simple inspecci�n. ¡Podemos pensar ahora en introducir cambios
de diversa naturaleza al gene de la adenilato ciclasa neuronal y observar qu�
efectos tienen sobre el aprendizaje de las moscas! Despu�s podemos tratar de
hacer un experimento similar; pero ahora con un rat�n.
Otro notable descubrimiento reciente se refiere a los mecanismos moleculares para la detecci�n de los olores. �ste es un fen�meno que ha fascinado a los cient�ficos por mucho tiempo. �C�mo podemos distinguir entre los miles o millones de diferentes aromas? En la actualidad los m�s complejos m�todos instrumentales de detecci�n de sustancias palidecen ante la sensibilidad y la capacidad de discernimiento de un sistema biol�gico.
�Todav�a utilizamos perros para detectar pistas o identificar drogas en las
maletas en los aeropuertos! Un experimento que inici� la resoluci�n del dilema
sobre el mecanismo de discriminaci�n de olores fue concebido por Leslie Buck,
una estudiante del postdoctorado que trabajaba en el laboratorio del doctor
Richard Axel, respetado bi�logo molecular estadunidense, quienes concibieron
que probablemente el problema de distinguir sustancias qu�micas muy diversas
podr�a resolverse con un mecanismo similar al de los anticuerpos (v�ase en este
cap�tulo, "Los anticuerpos y c�mo se producen"), es decir; a trav�s de un sistema
combinatorio. Pensaron que quiz� existir�a un conjunto de receptores (prote�nas
membranales) parecidos entre s�, pero cada uno capaz de interaccionar con alguna
parte diferente de un odorante. Con algunos cientos de receptores las c�lulas
de la nariz podr�an distinguir millones de diferentes olores. Esto ocurrir�a
si la respuesta de la c�lula depende de la combinaci�n de se�ales que se genera
de la estimulaci�n de conjuntos diferentes de receptores, diferentes para cada
odorante. A partir de este concepto se dieron a la tarea de identificar en los
ARN mensajeros producidos por las c�lulas correspondientes, conjuntos
de mol�culas que fueran similares, y pudieran ser la base de este mecanismo
que supusieron podr�a existir. Con gran satisfacci�n descubrieron que, en efecto,
las c�lulas sensibles al olor expresan un conjunto de receptores muy parecidos
entre s�, y relacionados con la percepci�n del olor. Aunque todav�a hay mucho
trabajo por hacer antes de desentra�ar claramente el mecanismo responsable de
este proceso, los descubrimientos descritos muestran c�mo el conocimiento previo
(sistema de anticuerpos), la imaginaci�n, y una poderosa metodolog�a nueva,
permiten los avances de la ciencia.
Evidentemente, las descripciones anteriores no abarcan los cientos de genes relacionados con la funci�n neuronal que se han estudiado utilizando ADN recombinante, s�lo intentan ilustrar algunas de las maneras como se han llevado a cabo estos estudios.
Conforme nos adentramos en identificar transacciones moleculares que afectan niveles superiores de la experiencia humana, las cosas se tornan muy interesantes. Y muy controvertidas.
Los avances del ADN recombinante est�n permitiendo proponer hip�tesis concretas, verificables, respecto de los condicionantes gen�ticos de formas complejas de comportamiento. Algunos reportes recientes ilustran estos conceptos.
A partir del an�lisis de una familia holandesa en la que los varones presentaban
con frecuencia trastornos de conducta (tales como comportamiento violento, incendiarismo,
exhibicionismo y otros), se identific� como probable al gene condicionante:
el que dirige la elaboraci�n de la enzima monoaminooxidasa, de cuya actividad
depende la formaci�n de ciertos neurotransmisores. Un par de a�os despu�s, se
report� el resultado de experimentos con ratones transg�nicos a los que inactiv�
espec�ficamente el gene de monoaminooxidasa.3
Se observ� que los ratones mostraban, entre otras deficiencias, un comportamiento
marcadamente agresivo.
Con una concepci�n similar, se han hecho recientemente propuestas sobre la posible identificaci�n de genes correlacionados con la homosexualidad. Por el momento, s�lo se ha establecido, por mapeo gen�tico, la posible localizaci�n gruesa de dicho gene, pero existe la posibilidad de identificarlo plenamente, tal y como se hizo para la fibrosis qu�stica (v�ase en el cap�tulo anterior, "Aislamiento de genes responsables de enfermedades hereditarias").
Es importante advertir, dicho lo anterior; que los nuevos conocimientos s�lo abren avenidas para enriquecer nuestra concepci�n de nosotros mismos, inmersos en la evidente complejidad de la naturaleza humana y las relaciones sociales. Es irresponsable hablar del descubrimiento del "gene del alcoholismo", como si estuviera seguro de una relaci�n causa-efecto exclusiva. Tambi�n ser�a irresponsable y empobrecedor ignorar la posible influencia de nuestra constituci�n gen�tica sobre nuestro comportamiento.
El desarrollo embriol�gico por el cual se genera un organismo completo a partir de un �vulo fecundado es uno de los procesos m�s fascinantes de la naturaleza. Los estudiosos de la embriolog�a han contemplado extasiados el proceso en el que a partir de c�lulas aparentemente id�nticas, se van creando estructuras cada vez m�s intrincadas; c�mo se va adquiriendo forma y funci�n.
Nuevamente es s�lo hasta la era del ADN recombinante que se ha podido empezar a entender los circuitos moleculares que subyacen en este proceso fundamental. Y nuevamente, el estudio de organismos modelo ha probado ser extraordinariamente importante.
El espacio nos constri�e a mencionar solamente una peque�a muestra de este efervescente campo de la biolog�a experimental moderna, tomando como ejemplo los llamados genes home�ticos, descubiertos en mutantes de Drosophila, en los que, en el desarrollo embrionario se obervaban fenotipos muy llamativos. En uno de ellos, denominado Antennapedia, las estructuras de las antenas son sustituidas por patas. En el bicoid, el embri�n se desarrolla con dos telsones o colas, sin t�rax ni cabeza (desde luego estas moscas mutantes en genes home�ticos no sobreviven despu�s de ciertos estadios del desarrollo).
Estas mutantes fueron aisladas hace varias d�cadas, y los genetistas moleculares modernos intuyeron que las lesiones deber�an encontrarse en genes de crucial importancia para el desarrollo, en alguno de los interruptores primordiales para la diferenciaci�n. En efecto, estos genes resultaron ser genes maestros, y sus equivalentes o similares luego fueron encontrados en toda la escala filogen�tica de los eucariontes: levaduras, plantas, animales, etc�tera.
Despu�s de una d�cada de experimentaci�n sabemos muchas cosas sobre muchos genes home�ticos. Estos son genes maestros que codifican para prote�nas que regulan la actividad del ADN. Las prote�nas que codifican se unen espec�ficamente a ciertas secuencias dentro de los cromosomas, activando o inhibiendo la expresi�n de genes particulares. Tambi�n se han aislado, en gran parte por los hallazgos de Drosophila, genes home�ticos de organismos superiores como el rat�n y el hombre. Continuamente aparecen nuevos genes y nuevos fenotipos causados por �stos.
En uno de los experimentos m�s llamativos realizados recientemente, se obtuvieron moscas transgen�ticas en las que un gene home�tico, que determina etapas fundamentales de la formaci�n de los ojos, se puso bajo el control de se�ales que activan genes en las patas. El resultado: �moscas con ojos perfectamente formados, pero creciendo precisamente en las patas!
Los nombres de algunos de los genes identificados en la mosca de la fruta nos indican el tipo de procesos que se est�n desentra�ando: daughterless (sin hijas), wingless (sin alas), hunchback(jorobada), hairy (peluda). Otros muestran la naturaleza jugetona de los investigadores: sonic que es parte del complejo de genes hedgehog (quiz� el lector recuerde al personaje del juego electr�nico Sega Genesis).
El estudio de las plantas, desde el punto de vista molecular; ha estado rezagado respecto al de otros organismos. Es quiz� una paradoja que las leyes fundamentales de la herencia fueron desarrolladas por Mendel utilizando plantas, y que la gen�tica molecular no se haya inclinado por �stas como uno de sus primeros objetos de estudio. Hay razones que explican esta situaci�n, que veremos m�s adelante.
El cultivo y manejo de las plantas constituye uno de los factores cruciales del desarrollo de la humanidad. La transici�n de las culturas de cazadores y recolectores a la vida sedentaria, basada en la agricultura, representa un parteaguas en la evoluci�n cultural. En este sentido, los pueblos han dedicado gran cantidad de su energ�a e imaginaci�n al mejoramiento y manejo de sus cultivos. La selecci�n de mejores variedades de plantas es una actividad que se ha llevado a cabo por milenios. En efecto, se han empleado las m�s refinadas t�cnicas emp�ricas y la gen�tica cl�sica para constituir una profesi�n que revest�a gran importancia hacia la mitad de este siglo. La llamada revoluci�n verde, que ha permitido incrementar de manera importante la productividad agr�cola, es fruto de la aplicaci�n de estas disciplinas.
Sin embargo, el arribo del ADN recombinante no tuvo en el �rea de plantas un impacto tan inmediato como el que vimos en el campo de la salud. Quiz� la raz�n principal es que los tiempos de generaci�n de las plantas las han hecho objetos de estudio bastante dificiles. La planta no ha sido un sistema modelo muy �til para resolver preguntas b�sicas de gen�tica molecular. Por supuesto que esta situaci�n no impidi� que se desarrollaran con ellas importantes estudios moleculares, pero no con la intensidad y abundancia que en microorganismos y animales. Esta situaci�n ha cambiado en la �ltima d�cada. Muchos grupos de investigaci�n han detectado la importancia de aplicar las t�cnicas de ADN recombinante a la biolog�a vegetal, y el gran potencial que tiene la manipulaci�n de las plantas para el bienestar de la humanidad. Una de las �reas m�s activas y promisorias de la biolog�a moderna es, hoy d�a, la biolog�a vegetal.
Ingenier�a gen�tica de plantas y la tecnolog�a
Describamos primero la explotaci�n de un fen�meno natural que ocurre entre
la bacteria Agrobacterium tumefaciens y ciertas especies vegetales. Agrobacterium
es capaz de invadir la planta e introducirle un segmento de ADN,
llamado pl�smido Ti, desarrollando eventualmente un tumor. Esto quiere
decir que una bacteria ha podido hacer plantas transg�nicas desde hace millones
de a�os. En efecto, parte del ADN del pl�smido Ti se integra
al genoma de la c�lula vegetal infectada y lo hereda establemente a las c�lulas
hijas. Otro fen�meno importante que facilita la ingenier�a gen�tica de plantas
es que �stas tienen gran capacidad de regeneraci�n: muchas plantas pueden regenerar
un organismo completo a partir de un pedacito sacado de una hoja. Con estos
elementos, se desarroll� el sistema b�sico para la ingenier�a gen�tica de plantas
(v�ase el recuadro IV.5). Uno de los protagonistas del desarrollo de esta tecnolog�a
fue el investigador mexicano, doctor Luis Herrera-Estrella, a principios de
los ochenta, quien se encontraba en aquel momento en B�lgica. Es curioso que
algunas de las contribuciones de importancia internacional de este otro cient�fico
mexicano consistieron en el desarrollo de veh�culos de clonaci�n (v�ase en el
cap�tulo II, "Concepto de clonaci�n molecular").
La posibilidad de regenerar plantas con genes ex�genos insertados, se ha constituido en un factor crucial para su estudio. Este mecanismo permite acortar significativamente el tiempo de muchas investigaciones que anteriormente requer�an experimentos de larga duraci�n, pues depend�an de la fertilizaci�n convencional de las plantas, y esperar que �stas crecieran y formaran semillas en cuesti�n de meses. Desafortunadamente, no todas las especies vegetales son susceptibles a la infecci�n por Agrobacterium, por lo que la manipulaci�n de muchas de �stas fue retrasada. En los �ltimos a�os, sin embargo, se han establecido mecanismos para transformar y regenerar plantas de muchas nuevas variedades, incluyendo especies de gran importancia agr�cola, como los cereales. Una de las maneras como se introducen genes hoy en d�a, es lo que se ha dado en llamar biobal�stica. Con esta t�cnica, el ADN se hace penetrar a las c�lulas vegetales atravesando la pared celular; viajando en proyectiles microsc�picos que simplemente se disparan hacia los pedacitos de hoja.
Otro de los aspectos m�s interesantes que se asocian a la biolog�a molecular
vegetal tiene relaci�n con los genes m�viles o saltarines. Ya hemos comentado
que la visi�n cl�sica consideraba al material gen�tico como un elemento fundamentalmente
estable (v�ase en este cap�tulo, "Los anticuerpos y c�mo se producen"). Este
material es responsable de la determinaci�n de las caracter�sticas de los nuevos
seres que permanecen de generaci�n en generaci�n. Se pensaba que los procesos
que daban origen a la evoluci�n de las especies eran fen�menos azarosos de cambio
donde se alteraban unas cuantas bases del ADN. En los a�os cincuenta,
sin embargo, una genetista de plantas, la doctora Barbara McClintock, describi�
fen�menos de variaci�n en el ma�z y propuso que la causa deber�a ser el movimiento
o salto de genes, de un lugar a otro del genoma. El trabajo de la doctora McClintock
no fue claramente apreciado hasta que este fen�meno se observ� tambi�n en la
mosca de la fruta. Finalmente, en 1983, Barbara McClintock fue galardonada con
el Premio Nobel de fisiolog�a o medicina, premiando as� su trabajo que conjuntaba
l�gica y m�todo impecables, pero tambi�n preclara intuici�n. Los elementos m�viles
han sido de gran utilidad para manipular el genoma de algunas variedades de
plantas, y tambi�n explican algunos de los fen�menos que en ellas observamos.
Una de las historias m�s notables que he escuchado se refiere precisamente a esto. Nos la relat� la doctora Virginia Walbot, investigadora de la Universidad de Stanford, en una reciente visita al Instituto de Biotecnolog�a de la UNAM.
Entre los objetos de estudio de la doctora Walbot se encuentran los elementos m�viles del ma�z. En sus investigaciones hab�a descubierto que algunos de estos elementos se mueven de manera excesiva en muchas variedades de ma�z, ocasionando que se produzca un elevado n�mero de mutaciones. En su b�squeda del origen de estos elementos, la doctora Walbot descubri� que �ste se pod�a identificar en una variedad de ma�z proveniente de la zona zapoteca, del estado de Oaxaca. La variedad llamada zapalote chico contiene estos elementos m�viles, pero los puede mantener bajo control. Si se cruza el zapalote chico con otras variedades de ma�z, el elemento movil pasa al entorno gen�tico que ya no lo controla, causando su degeneraci�n. Antiguas leyendas que datan de hace muchos siglos amenazaban a los enemigos del pueblo zapoteca con las terribles consecuencias de robarse su ma�z sagrado. �Los dioses castigar�an al ladr�n haciendo que sus cosechas se echaran a perder! Hoy d�a estamos conociendo las causas moleculares de la mitol�gica maldici�n.
As� pues, aunque durante milenios, el hombre se ha dedicado a mejorar las variedades de plantas que cultiva, la ingenier�a gen�tica ha hecho posible, en poco m�s de una d�cada, que se abra un nuevo panorama para el conocimiento y la manipulaci�n de este patrimonio fundamental de la humanidad.
EL GRAN PROYECTO PARA SECUENCIAR EL GENOMA HUMANO
Una vez revisados algunos de los logros recientes de la biolog�a experimental, resulta m�s f�cil entender la convicci�n de los bi�logos moleculares de que el ADN recombinante ir� permitiendo abordar grandes problemas, que previamente se percib�an inaccesibles. Esto ha dado como resultado que muchas de las �reas de investigaci�n que en el presente manifiestan intensa actividad fueran propuestas desde mucho antes: �ste es el caso del estudio molecular del genoma humano. Desde inicios de los a�os ochenta, hubo iniciativas para generar un mapa f�sico y gen�tico de todo el genoma humano de manera sistem�tica. La meta de largo plazo seria, obviamente, el conocimiento �ntimo de todo el genoma, es decir; conocer toda su secuencia. Pero veamos paso a paso lo que significa esto.
Todos sabemos que nuestro genoma est� repartido en 23 pares de cromosomas: �ste es el nivel m�s grueso de mapeo gen�tico. Pero �qu� podemos decir respecto a qu� genes se encuentran en cu�les cromosomas? �Qu� genes est�n cerca de cu�les otros? Esta localizaci�n relativa de los genes constituye un paso siguiente de finura o resoluci�n del mapa. Finalmente, la descripci�n de la secuencia de bases de cada uno de los cromosomas, desde su principio hasta su final, es el grado m�ximo de precisi�n alcanzable.
Pero ya sabemos que la longitud de cada cromosoma es realmente gigantesca. Llegar a conocer la secuencia completa de siquiera uno de ellos resulta una labor tit�nica. El m�s peque�o de los cromosomas humanos, el cromosoma Y est� constituido por una hebra de alrededor de 60 millones de bases. Reconociendo lo formidable de la tarea de secuenciar todo el genoma, el progreso del conocimiento en lo que se refiere a secuencias de genes humanos fue desarrollado de manera independiente por grupos de investigaci�n interesados en genes espec�ficos. Esto es, hasta 1986, fue cuando empez� a gestarse una iniciativa para lanzar un gigantesco proyecto internacional que lograra descifrar toda la secuencia de los cromosomas humanos en un plazo razonable.
Como todo gran proyecto, el del genoma humano ha generado buen n�mero de controversias. Muchos pensaron que no ten�a sentido lanzar un gran programa para secuenciar algo que de todas maneras no �bamos a saber interpretar de inmediato. Adem�s, sabemos de antemano que el 95% de las secuencias presentes en nuestros cromosomas no codifican para ninguna funci�n directamente y que muchas de ellas no son mas que m�ltiples repeticiones de lo mismo. Algunos se�alaron que era insensato canalizar los fondos, que normalmente se otorgaban a investigaciones bien cimentadas, en las que se persiguen y estudian genes y funciones espec�ficas, para financiar un gran proyecto que pretende estudiar algo que en el 99% de los casos no vamos a saber entender ni aplicar.
Los argumentos anteriores son bastante s�lidos y quiz� fueron compartidos por gran parte de la comunidad cient�fica. Pero entre los promotores de la idea de secuenciar el genoma humano, se encontraban algunos de los personajes m�s notables y respetados entre los bi�logos moleculares (por ejemplo, James Watson, ni m�s ni menos). Ellos tambi�n ten�an argumentos muy interesantes. Para los promotores de la idea, el desv�o de los fondos no era una realidad, ya que el Proyecto se ir�a financiando con fondos nuevos, que en realidad ganar�a para s� la ciencia biol�gica, y se acceder�a al mismo tipo de status que ten�a la f�sica, con sus proyectos internacionales multimillonarios. Seg�n este grupo, el conocimiento que se deriva de estudiar el genoma como un todo, es mucho m�s atractivo que el que se obtiene de irlo estudiando por partes. Quiz� uno de los elementos mas interesantes en favor de la idea es que este gran proyecto internacional promover�a de manera definitiva el avance de todas las t�cnicas relacionadas. De hecho, desde un principio se plante� el proyecto sobre la base de que la eficiencia de las t�cnicas utilizadas para determinar la secuencia del ADN tendr�a que incrementarse entre 100 y mil veces. Pero esto se consideraba posible lograrlo en un plazo de menos de 10 a�os a partir del inicio del proyecto.
Finalmente se impuso el grupo a favor y el Proyecto Genoma Humano ha arrancado desde inicios de esta d�cada. Se han organizado consorcios internacionales en los que participan laboratorios de muchos pa�ses. Creo que r�pidamente hemos atestiguado la aparici�n de un fen�meno muy interesante, que es la organizaci�n de colaboraci�n a gran escala. De esta Organizaci�n empezaron a surgir ideas nuevas sobre c�mo distribuir el trabajo, qu� requisitos t�cnicos hay que cubrir antes de empezar a secuenciar en gran escala, etc. En efecto, el gran proyecto internacional ha empezado a generar avances que de otra manera quiz� no hubieran ocurrido. Algunos de los aspectos m�s notables de modo de operar de este gran proyecto internacional ilustran su envergadura y se describen a continuaci�n.
Nuevas t�cnicas de secuenciaci�n
Los bi�logos moleculares se han dedicado con ah�nco a secuenciar genes durante
los �ltimos 15 a�os. Consideremos, sin embargo, que la gran base de datos acumulada
hasta el momento est� constituida por unos 550 mil segmentos de genes y alrededor
de 385 millones de pares de bases en total.4
Las cifras anteriores incluyen genes de todos los organismos
para los que se ha obtenido alguna secuencia. El esfuerzo para secuenciar todo
el genoma humano tendr�a una magnitud unas 10 veces de lo que se ha hecho hasta
la fecha. Claramente, se requiere acelerar y abaratar los m�todos de secuenciaci�n.
Impulsados por los fondos y el entusiasmo generado por el Proyecto Genoma Humano, diversos laboratorios y compa��as se han dado a la tarea de desarrollar m�todos nuevos que en muchos casos representan gran originalidad y ambici�n.
En estos momentos, por ejemplo, se est�n activamente desarrollando sistemas para secuenciar utilizando un chip, mediante t�cnicas de hibridaci�n de ADN. Estos chips consistir�an en arreglos de oligonucle�tidos peque�os, dispuestos en filas y columnas casi microsc�picas. Se ha podido demostrar que si se hace hibridar un segmento de ADN de secuencia desconocida con uno de estos arreglos, la especificidad de la asociaci�n permite observar un patr�n de casillas positivas (donde el ADN desconocido se asoci�) y negativas (donde no se asoci�), a partir del cual es posible deducir, inequ�vocamente, la secuencia desconocida. La lectura del patr�n puede ser miniaturizada y automantizada, utilizando lectores de fluorescencia l�ser, conectados a una computadora.
En otro notable desarrollo se plantea utilizar sistemas de electroforesis, pero en una novedosa versi�n que utiliza tubos capilares (de di�metros microsc�picos). Este tipo de electroforesis puede ser completamente automatizada, y los experimentos se realizan en mucho menos tiempo que con la electroforesis convencional. Se est�n construyendo y desarrollando m�quinas que contienen arreglos de decenas de capilares, que se utilizan simult�neamente y, nuevamente por fluorescencia l�ser, se detectan cantidades m�nimas de la muestra y alimentan la computadora.
Existen varios dise�os adicionales, muy ingeniosos, cuya finalidad es la misma: abaratar y acelerar la adquisici�n de datos de secuencia. Es importante considerar que antes de iniciar el Proyecto Genoma Humano, la t�cnica de secuenciaci�n de ADN ten�a un costo de entre uno y dos d�lares por cada base. �Secuenciar el genoma humano con estas t�cnicas costar�a cerca de 5 mil millones de d�lares! Los laboratorios que forman parte del consorcio Genoma Humano ya est�n secuenciando (con t�cnicas convencionales) con costos de alrededor 20 cts. de d�lar por base, pero todav�a queda mucho por avanzar.
T�cnicas de mapeo y clasificaci�n
Muy pronto qued� claro para los participantes del gran proyecto que el esfuerzo de secuenciaci�n masivo deb�a diferirse y que, como prerrequisito, se deb�a tener un mapa y un conjunto de fragmentos donados que representaran segmentos de los cromosomas identificados en ese mapa. Para lograr este objetivo, se han llevado a sus l�mites otras t�cnicas muy interesantes.
En primer t�rmino, se dispone ahora de m�todos automatizados para separar cromosomas
individuales. Se puede utilizar una m�quina llamada FACS (fluorescence
activated cell sorter). Con este equipo se produce un flujo de gotitas microsc�picas,
a partir de una preparaci�n que contiene cromosomas previamente extra�dos de
c�lulas vivas. A trav�s de una sonda de ADN que hibrida espec�ficamente
con un cromosoma determinado (recordemos que hay ya un buen n�mero de genes
identificados para los que se sabe en qu� cromosoma se encuentran), y que lleva
una marca fluorescente, se puede lograr que el dispositivo FACS
identifique qu� gotitas contienen un cromosoma marcado, induzca una carga electrost�tica
en esas gotitas y, mediante un campo el�ctrico de corta duraci�n, las saque
del flujo principal para recolectarlas en un tubo separado. Esta operaci�n se
puede realizar miles de veces por segundo, logrando as� colectar cantidades
importantes de cromosomas puros que fueron seleccionados uno por uno. El siguiente
paso ser�a someter el ADN de estas preparaciones a alguna enzima
de restricci�n y clonarlo para obtener una genoteca. El problema que se enfrenta
es que con un veh�culo molecular convencional se pueden albergar solamente un
m�ximo de alrededor de 10 mil pares de bases, as� que el m�s peque�o de los
cromosomas humanos requerir�a de m�s de 6 mil clonas para estar representado
en la genoteca. Se hizo necesario desarrollar m�todos m�s ambiciosos para tener
genotecas m�s manejables. Uno de los m�todos utilizados consiste en generar
cromosomas artificiales de levaduras (YACs, por sus siglas en ingl�s
yeast artificial chromosome). Los YACs pueden contener cientos
de miles o millones de pares de bases. As�, un cromosoma puede ser dividido
en s�lo algunas decenas o cientos de YACs .
La comunidad internacional del proyecto se ha distribuido el estudio de los cromosomas humanos, y cada laboratorio se est� dedicando a generar una genoteca de YACs representativa del cromosoma que le fue encomendado. La actividad de los consorcios internacionales dedicados al Proyecto Genoma Humano constituye un ejemplo muy interesante de la labor cient�fica en gran escala. Aqu�, por ejemplo, participan diversos especialistas que provienen de disciplinas variadas. La identificaci�n de "marcadores" f�sicos y gen�ticos en los cromosomas humanos ha sido una actividad que se llev� a cabo por mucho tiempo. La descripci�n del significado preciso de estos t�rminos est� fuera de los alcances de este libro; pero baste se�alar que existen estos antecedentes, basados en t�cnicas complejas, y que hoy d�a se complementan con metodolog�a de ADN recombinante. La reacci�n en cadena de polimerasa (PCR), por ejemplo, se est� utilizando activamente para obtener una clasificaci�n reproducible y confiable de peque�os segmentos marcadores presentes en estas colecciones.
En el momento de la impresi�n de este libro, acicateada por la publicaci�n de la secuencia de los primeros genomas bacterianos completos (v�ase la siguiente secci�n), la organizaci�n del Proyecto Genoma Humano estaba considerado iniciar la etapa de secuenciaci�n a gran escala. La expectativa es que se pueda completar la empresa a tiempo, antes del objetivo de 10 a�os en el a�o 2003.
El lector seguramente observar� que la actividad descrita ha ido generando un gigantesco c�mulo de datos que, ya en el momento presente, s�lo son manejables con t�cnicas computacionales.
Imaginemos la tarea que representa descifrar el mensaje de un solo gene. Nos enfrentamos con una larga secuencia de, digamos 1 000 bases. A simple vista s�lo vemos una interminable lista de As, Gs, Ts y Cs. Parte de esta secuencia constituye se�alamientos para encender y apagar la expresi�n del gene (v�ase el recuadro IV.1). El gene estructural contiene el mensaje que determina la secuencia de la prote�na codificada. Nos llevar�a un buen rato, utilizando el c�digo gen�tico, realizar la simple tarea de escribir la secuencia de amino�cidos de la prote�na. Realmente el cerebro humano no es muy eficiente para estos menesteres. Las computadoras son, en cambio, extremadamente eficientes. Una computadora casera har�a la traducci�n en una fracci�n de segundo.
Afortunadamente, el crecimiento de la eficiencia de las computadoras ha mantenido, y excedido, el paso que lleva la acumulaci�n de datos. El manejo de secuencias biol�gicas se ha hecho siempre en las computadoras disponibles m�s potentes. Cuando la base de datos era peque�a (unos cuantos miles de pares de bases) a principios de la d�cada, para su an�lisis eran suficientes las computadoras de entonces. Hoy d�a, el an�lisis de cientos de millones de pares de bases requiere de computadoras muchas veces m�s poderosas, y que afortunadamente ya existen.
Desde su inicio, por lo tanto, el Proyecto Genoma Humano ha puesto una gran atenci�n en el desarrollo de la herramienta computacional necesaria para el an�lisis de los datos que se est�n generando. El consorcio internacional organiza, de hecho, una red de intercambio de datos, por medio de la red Internet, que enlaza millones de computadoras en todo el mundo. Esta gran comunidad esta as� conectada continuamente, y puede acceder a los datos generados en todos los dem�s laboratorios casi simult�neamente a la producci�n de ellos. Se puede decir, incluso, que el fomento de una cultura de colaboraci�n electr�nica internacional en el �rea biol�gica, se ha debido en gran parte a la organizaci�n y manejo de estas grandes bases de datos.
Secuenciaci�n de otros genomas
De manera simult�nea al lanzamiento del Proyecto Genoma Humano, se dio gran impulso a los esfuerzos para secuenciar otros genomas de organismos modelo. Como es de esperarse, estos organismos modelo son los que se han seleccionado para su estudio desde hace varias d�cadas (v�ase en el cap�tulo anterior, Diversos niveles de complejidad"): Escherichia coli (bacteria), Sacharomyces cereviciae (levadura), Caenorhabditis elegans (gusano simple), Drosophila sp. (insecto), Arabidopsis thaliana (planta), Mus musculus (mam�fero).
A la fecha de la �ltima revisi�n de este libro, la comunidad internacional de biolog�a molecular se encontraba celebrando la aparici�n de la secuencia completa de los genomas de algunos organismos simples: la organizaci�n TIGR (The Institute for Genomic Reserach influenzae y Microplasmas genitalium. Se dispondr� tambi�n de la secuencia completa del primer eucarionte, Sacharomyces cereviciae (levadura de pan). Claramente, ha surgido un nuevo modo de ver el patrimonio gen�tico, ahora como un todo.
La ventaja que representa el conocimiento de estos genomas es clara. En primer lugar, es posible realizar experimentaci�n, altamente sofisticada, con estos organismos. En segundo lugar, representan modelos m�s simples de organizaci�n, donde los fen�menos pueden resultar m�s f�ciles de entender e interpretar.
Uno de los aspectos m�s gratificantes del estudio de organismos modelo proviene del hecho, descrito en el cap�tulo I, de que los organismos se parecen mucho unos a otros en el nivel molecular. As�, el descubrimiento de genes en una bacteria, levadura o insecto, con frecuencia puede decirnos algo sobre genes humanos, ya que es muy frecuente que exista una contraparte humana para el gene en cuesti�n. Esta reflexi�n nos da paso al tema de la siguiente secci�n, en donde se ve el tipo de conocimientos que se pueden derivar de comparar unas secuencias biol�gicas con otras, sea dentro de una misma especie, o entre especies diferentes.
COMPARACI�N DE SECUENCIAS: FILOGENIA Y PALEONTOLOG�A MOLECULARES
"Nada tiene sentido en biolog�a, si no es a la luz de la evoluci�n", dice Theodosius Dobshansky, el c�lebre evolucionista. La verdad de esta afirmaci�n es particularmente aparente al comparar las secuencias de las mol�culas biol�gicas. Charles Darwin, fundador de la etapa cient�fica de la teor�a de la evoluci�n previ� que alg�n d�a podr�amos establecer todas las relaciones filogen�ticas existentes entre los organismos vivientes. La posibilidad de utilizar secuencias de ADN y prote�nas nos acerca, como nunca antes, a esta meta.
Quiz� sea f�cil concordar con la idea de que un perro y un lobo tienen mucho en com�n. Cuando se afirma que hace algunos millones de a�os no hab�a lobos ni perros, sino un canino que origin� a ambos, �sta parece una aseveraci�n bastante l�gica. Sin embargo, si alguien dice que tenemos m�s en com�n con una levadura de pan que con las bacterias del yogurt podr�a intrigar m�s en qu� se basa quien afirme tal cosa. Desde luego que los estudiosos de la evoluci�n han observado, desde hace m�s de un siglo, mucho m�s que la apariencia externa y otros caracteres superficiales para establecer relaciones filogen�ticas. Pero la aportaci�n de la biolog�a molecular y el ADN recombinante ha revolucionado este campo en los �ltimos a�os.
El mismo hecho que posibilita el ADN recombinante sugiere la similitud molecular de los organismos vivos. Todos contienen ADN, prote�nas, ribosomas, y se rigen por el mismo c�digo gen�tico. Aunque este hecho era aceptado desde hace varias d�cadas, la acumulaci�n de datos de la secuencia que surge del empleo de la ingenier�a gen�tica le ha dado cuerpo y solidez. Hoy d�a podemos comparar las secuencias de diversos genes y prote�nas, a lo ancho de toda la escala filogen�tica, y responder preguntas extremadamente interesantes.
El parecido entre un organismo y otro, revelador de un origen com�n, se manifiesta
en las secuencias de sus genes. Por ejemplo, entre una persona y otra, m�s del
99.9% de las secuencias son iguales. Entre un humano y un chimpanc�, alrededor
de 99% de la secuencia es igual. (Tomemos en cuenta, sin embargo, que una diferencia
de 1%, en un genoma de 3 mil millones de bases, constituye todav�a una cifra
elevada: 30 millones de bases distintas. No sabemos cu�ntas o cu�les de las
diferencias, a nivel del genoma, son importantes para dar origen a las diferencias
observables entre una especie y otra.) Estas similitudes y diferencias se pueden
analizar por t�cnicas que eval�an el parecido global del ADN, mediante
t�cnicas de velocidad de reasociaci�n entre un ADN y otro, pero
se pueden analizar a un nivel m�s fino, comparando las secuencias de genes individuales.
Hay genes (y sus correspondientes proteínas) que difieren m�s que otros cuando
se comparan dos especies. Algunas de las prote�nas componentes de las c�lulas
requieren conservar su estructura y secuencia de manera precisa, mientras que
otras pueden mantener su funci�n �til aunque su secuencia var�e considerablemente.
Lo interesante de esta situaci�n es que podemos utilizar ciertos genes para
comparar especies muy cercanas (o poblaciones dentro de una misma especie) y
otros para comparar especies muy lejanas (v�ase el recuadro IV.6). Por medio
de la comparaci�n de secuencias de genes se han realizado hallazgos que empiezan
a revolucionar nuestra concepci�n de las relaciones entre los seres vivientes.
Tal como lo afirma Russell Doolittle, reconocido analista de secuencias moleculares,
quien se considera un paleont�logo, pero no usa palas ni desentierra huesos;
sus herramientas son una computadora y los datos en secuencia que se generan
en cientos de laboratorios alrededor del mundo.
Para comparar poblaciones humanas, se pueden usar secuencias de las mitocondrias
(que son organelos celulares que se encargan de transformar energ�a). Estos
organelos contienen ADN probablemente de una simbiosis en la que
una bacteria coloniz� el interior de una c�lula eucarionte. Las mitocondrias
se heredan fundamentalmente de la madre, dado que los espermatozoides contribuyen
con una �nfima proporci�n de las mitocondrias al fecundar el �vulo. Esto hace
que sea m�s f�cil establecer relaciones entre grupos cercanos utilizando secuencias
de ADN mitocondrial.
En un estudio reciente, cuyas conclusiones son a�n controvertidas, se utilizaron
secuencias de ADN mitocondrial para establecer que todas las poblaciones
humanas provienen de una hembra que vivi� en África hace unos 200 mil
a�os. Esta interpretaci�n ha establecido un serio cuestionamiento sobre los
conceptos cl�sicos de la paleontolog�a humana. Es decir, la afirmaci�n de que
todos los humanos que vivimos actualmente descendemos de una hembra en particular
(por lo que se refiere el estudio a Eva), realmente debe interpretarse como
que se analiz� el linaje femenino, que se observa en las mitocondrias, pero
desde luego en todo el proceso, y desde incontables generaciones atr�s, los
humanos descienden de machos y hembras reproduci�ndose de manera normal.
Por otra parte, lo que el estudio realmente puede indicar, es que todos los humanos descienden de una poblaci�n africana que vivi� hace unos 200 mil a�os.
La controversia que este tipo de estudios suscita ilustra un aspecto muy interesante del quehacer cient�fico. En este caso, los paleont�logos tradicionales cuentan con un importante c�mulo de datos, proporcionados por el registro f�sil, y toda una serie de teor�as e interpretaciones de estos datos. La revoluci�n establecida por la disponibilidad de secuencias de mol�culas biol�gicas resulta de que algunas de las teor�as en boga se ven reforzadas, mientras que otras se ponen en entredicho. Los cient�ficos, al igual que todos los seres humanos, establecen lazos afectivos con sus creaciones (por ejemplo, sus teor�as), y se apegan a los m�todos de an�lisis que les son familiares. Seguramente, la irrupci�n de los bi�logos moleculares en la escena de la evoluci�n natural y, en particular, la humana, continuar� suscitando controversia. A la larga, ser� de la integraci�n de las diversas disciplinas de donde obtendremos las respuestas m�s satisfactorias a nuestra curiosidad sobre el origen del hombre.
Refinamiento de la clasificaci�n de organismos
El uso de ADN mitocondrial permite la comparaci�n de poblaciones
humanas, usando secuencias de genes que han cambiado en forma extraordinariamente
lenta se puede atizbar en las relaciones entre organismos mucho m�s distantes.
Los genes que codifican para el ARN, que forma parte de los ribosomas
(v�ase el cap�tulo I, el recuadro I.2), se parecen tanto que podemos usarlos
para comparar grupos tan lejanos como plantas con animales, o bacterias y hongos,
por ejemplo.
Los datos generados por la comparaci�n de secuencias de ARN ribosomal indican que la clasificaci�n cl�sica de los reinos (plantas, animales, hongos, monera y proroctista), no corresponde a las ramas m�s primigenias. En su lugar se sugiere introducir una nueva clasificaci�n, usando un nuevo concepto de tres dominios: bacteria, arquea y eucaria. De manera similar, mediante la comparaci�n de secuencias de genes, cuya divergencia es intermedia, se est� revisando la clasificaci�n a todos los niveles, estableciendo relaciones m�s seguras entre diversas plantas, animales, etc�tera.
Recuperaci�n de ADN f�sil
mediante la reacci�n en cadena de polimerasa (pcr)
Como ya mencionamos en el cap�tulo II, la reacci�n en cadena de polimerasa
permite obtener grandes cantidades de ADN a partir de cantidades
min�sculas, incluso de una sola mol�cula. As� pues, basta el material gen�tico
de unas cuantas c�lulas para poder estudiarlo. Esta potente herramienta est�
siendo utilizada en todos los �mbitos del ADN recombinante, en
sus facetas b�sica y aplicada, a menos de 10 a�os de su creaci�n.
Una de las aplicaciones m�s sorprendentes del m�todo de la PCR lo constituye la recuperaci�n y secuenciaci�n de segmentos de genes de muestras muy antiguas. Varios investigadores pensaron que era concebible que material biol�gico preservado por diferentes procesos de fosilizaci�n contuviera a�n cantidades detectables de ADN. As� pues, se dieron a la tarea de tratar de aislar algunos de estos segmentos de material gen�tico usando la PCR. Para sorpresa de muchos, efectivamente ha sido posible amplificar y secuenciar diversos segmentos de ADN a partir de muestras de incre�ble antig�edad. El proceso de fosilizaci�n por �mbar ha sido especialmente benigno para la preservaci�n del material biol�gico. El �mbar es un material resinoso, producto secretado por los �rboles, que en ocasiones atrapa materiales biol�gicos como hojas o peque�os insectos. Algunas de las muestras preservadas en �mbar tienen varios millones de a�os de antig�edad y muestran con toda claridad los caracteres morfol�gicos de los seres que ah� quedaron atrapados. Entre los ejemplos m�s notables de muestras estudiadas hasta la fecha se encuentran los restos de una planta de unos 40 millones de a�os de antig�edad, y de un gorgojo que cuenta con alrededor de 120 millones de a�os.
Es importante hacer notar que todav�a existe controversia acerca de la validez
de este tipo de estudios. Es de esperarse que el ADN en muestras
de millones de a�os de antiguedad se encuentre severamente da�ado y fragmentado
por procesos qu�micos espont�neos. En opini�n de algunos, aun la incre�ble preservaci�n
del aire y el agua que el �mbar parece ofrecer no ser�a suficiente para mantener
el ADN en un estado tal para ser estudiado. Asimismo, se acepta
un�nimemente que la recuperaci�n de ADN dé muestras, aun
de las relativamente reciente (por ejemplo, momias o animales extintos hace
unos pocos miles de a�os), ser� siempre fragmentaria, incompleta.
Esta capacidad parcial de atisbar en el pasado de la evoluci�n biol�gica promete una gama muy interesante de estudios que indudablemente contribuir�n a nuestros conocimientos. Ya sabemos, por ejemplo, que los mamuts eran parientes m�s cercanos del elefante africano que del asi�tico. O que el tigre dientes de sable pertenec�a a la familia de los grandes felinos, muy cercano a leones y tigres, pero m�s alejado de los pumas.
Las posibilidades de esta tecnolog�a tambi�n ha incitado a la imaginaci�n. La idea central de la novela Parque Jur�sico, del escritor Michael Crichton, se basa, precisamente, en esta capacidad real de recuperar ADN muy antiguo. Evidentemente, la distancia que existe entre aislar y secuenciar alg�n peque�o fragmento de ADN prehist�rico y la de reconstruir el genoma completo de un organismo es abismal. Un obst�culo quiz� todav�a m�s importante lo constituye el hecho de que el ADN, por s� mismo, no es capaz de realizar funci�n biol�gica alguna. Requiere estar empaquetado en cromosomas y con toda la maquinaria celular a su disposici�n para poder expresarse. Durante miles de millones de a�os una c�lula s�lo ha provenido de otra c�lula, llevando consigo, no s�lo el ADN, sino tambi�n una buena parte del resto de los componentes celulares. Creo que no es dif�cil predecir que la reconstrucci�n total de la m�s simple de las c�lulas (por ejemplo, la de una bacteria), a partir de sustancias qu�micas aisladas, es una empresa de tan gigantescas proporciones que habr�n de pasar muchas d�cadas antes de que pueda lograrse.
REFLEXI�N SOBRE EL IMPACTO DEL CONOCIMIENTO BIOL�GICO
En el cap�tulo que aqu� concluye, se presenta una muestra m�nima de la avalancha
de conocimientos generados a partir del ADN recombinante. Si nos
detenermos un minuto a reflexionar, las mujeres y los hombres que vivimos hoy
somos los primeros que tenemos acceso a un conocimiento m�s o menos coherente
de nuestra naturaleza biol�gica. La fechas que marcan la formulaci�n y demostraci�n
de conceptos verdaderamente fundamentales son todas incre�blemente recientes!
Las decenas de miles de generaciones de Homo sapiens que nos precedieron, han centrado sus reflexiones en las facetas trascendentes (religiones, sistemas filos�ficos) y sociales de la naturaleza humana. Dos conceptos inherentes a nuestra naturaleza psicol�gica y biol�gica fueron (por necesidad) de �ndole tentativa o especulativa. S�lo ahora contamos con los elementos para integrar una nueva concepci�n del cosmos y de nuestra naturaleza. Es �ste un gran reto para nuestra generaci�n y las que nos suceder�n.
