III. AISLANDO GENES: CASOS DE LA VIDA REAL

HASTA el momento hemos descrito una serie de manipulaciones que ocurren de manera muy simple. En las �pocas pioneras del ADN recombinante, la donaci�n de cada nuevo gene resultaba ser un hecho importante. En este cap�tulo, conforme se presentan ejemplos de aislamiento y caracterizaci�n de genes espec�ficos, iremos viendo c�mo entran en juego los diferentes problemas que se requiere resolver. M�s interesante a�n, es que podremos explorar las formas ingeniosas y la gran cantidad de trabajo que se ha requerido para sortear estos problemas. Actualmente, el aislamiento de ciertos genes es una tarea sencilla, casi rutinaria. Espec�ficamente, la relativa simplicidad de los genomas de bacterias presenta pocas dificultades al arsenal de t�cnicas contempor�neas. El caso de un gene humano, sin embargo, es una historia muy distinta. Un gene humano se encuentra disperso en alguno de los 23 cromosomas, constituyendo quiz� menos de la diezmil�sima parte del mismo. Aun cuando hoy d�a conocemos la secuencia de miles de genes humanos, fruto del esfuerzo de muchos laboratorios de todo el mundo, el aislamiento de ciertos genes clave sigue ocupando los titulares de revistas cient�ficas. Para comprender la admiraci�n que inspira la culminaci�n de una de estas empresas, revisaremos una serie de procedimientos que se han dise�ado para el aislamiento de genes.

DIVERSOS NIVELES DE COMPLEJIDAD

Como se mencion�, los organismos unicelulares, los m�croorganismos, contienen cantidades mucho menores de material gen�tico que los organismos superiores. Esto no impide que constituyan un grupo extremadamente diverso entre los seres vivos. Existe, pues, una enorme riqueza en los genes de estos organismos que se han adaptado a vivir en los m�s variados y extremosos ambientes. El inter�s de los cient�ficos por el mundo microbiano mantendr� un paso acelerado en la b�squeda del conocimiento sobre las caracter�sticas de sus genes y su regulaci�n. Adicionalmente, dada su simplicidad relativa, estos organismos constituyen excelentes modelos para estudiar la forma como los genes orquestan la actividad de las c�lulas: las bacterias usualmente tienen genomas con menos de cinco o 10 millones de pares de bases; muy simples si las comparamos con el genoma de un vertebrado, de m�s de mil millones de pares de bases.

Pasemos ahora a tratar un aspecto quiz� poco conocido respecto a la ciencia biol�gica experimental. Se dice que la diferencia entre un ingeniero y un cient�fico es que el primero resuelve los problemas que necesitan ser resueltos, mientras que el segundo, aquellos que pueden ser resueltos. En su b�squeda de conocimiento, el cient�fico requiere seleccionar preguntas que sean abordables. El conocimiento se va construyendo paso por paso, de manera creciente, por lo que hay preguntas que no pueden ser resueltas en tanto no se tengan fundamentos previos. Desde luego, siempre estamos tironeados por dos fuerzas: las del inter�s por resolver preguntas que nos son cercanas (porque ata�en a la naturaleza humana o a las enfermedades que nos aquejan, por ejemplo), y las de la curiosidad por resolver problemas fundamentales que sabemos que se deben rendir pronto con las herramientas y conocimientos de los que ya disponemos. Esto hace que los proyectos cient�ficos se dividan en b�sicos y aplicados. En realidad, cada d�a est�n m�s cercanos los grupos que cultivan ambas modalidades: incluso muchos cient�ficos abordan tanto problemas b�sicos como aplicados. Los proyectos de investigaci�n b�sica formulan preguntas fundamentales, y deben dise�ar los sistemas experimentales que permitan resolverlas. En el curso de la historia de la ciencia biol�gica, se han desarrollado "modelos" que son particularmente atractivos para responder ciertas preguntas. As�, por ejemplo, Mendel estudiaba las leyes fundamentales de la gen�tica con la planta de ch�charo: �l pod�a distinguir caracter�sticas determinadas por los genes con gran facilidad, los ch�charos eran lisos o rugosos, amarillos o verdes. En tiempos m�s recientes se han ido escogiendo otros modelos, cada uno con atractivos particulares.

En el nivel m�s simple se estudian las bacterias y sus virus. La bacteria favorita, cuyo estudio estableci� el desarrollo de la biolog�a molecular, es Escherichia coli, el bacilo del colon humano. Las variedades originalmente estudiadas ni siquiera causan enfermedades ni son particularmente ben�ficas para el hombre. Su atractivo deriva de su relativa simplicidad y de que se reproducen a gran velocidad, duplic�ndose cada 20 minutos. En el siguiente nivel se encuentran otros organismos unicelulares: las levaduras. Aqu� se pueden encontrar fen�menos distintos, propios de organismos m�s complejos. Las levaduras son organismos eucariontes, por lo que su organizaci�n gen�tica es mucho m�s cercana a la de plantas y animales que a la de las bacterias. Continuando en la escala ascendente de complejidad encontramos otro organismo modelo, un gusano llamado Caenorhabditis elegans. �Por qu� escoger este organismo como modelo? Nuevamente, no es pat�geno ni resulta ben�fico. La raz�n se debe a que es un organismo pluricelular en el que se pueden estudiar fen�menos de diferenciaci�n o especializaci�n de c�lulas para crear tejidos y �rganos, aunque todos ellos muy simples: cada uno de estos gusanitos est� constituido por 1090 c�lulas exactamente. El genoma de este organismo est� estudi�ndose intensamente y probablemente ser� el primer genoma de un organismo pluricelular del que conozcamos su secuencia completa. En niveles sucesivos de complejidad existe una planta modelo, Aratidopsis thaliana; la mosca de la fruta (Drosophila sp.) y el rat�n (Mus musculus). Lo que aprendemos de estos organismos modelo es de incalculable valor para poder enfrentar los problemas de estudio y manejo de especies de importancia aplicada. Dada la asombrosa similitud de unos organismos y otros, a nivel de sus mol�culas fundamentales, los genes que se a�slan del rat�n, de la mosca de la fruta, y hasta de las bacterias, nos proporcionan mucha informaci�n de nuestros propios genes, o de los del trigo y el ma�z.

En las siguientes secciones se describen los diversos enfoques que se han desarrollado para estudiar los genes de los diversos organismos, y se ir� viendo c�mo las t�cnicas que ha sido necesario implementar, responden precisamente a sus diferentes niveles de complejidad.

AISLAMIENTO DE GENES POR COMPLEMENTACI�N

Los primeros genes microbianos fueron aislados mediante el principio de la complementaci�n. Este procedimiento se fundamenta en el trabajo previo de los genetistas que, desde mucho tiempo atr�s, hab�an caracterizado indirectamente a los genes. El trabajo cl�sico en gen�tica microbiana implicaba el aislamiento y caracterizaci�n de bacterias mutantes, es decir, variantes que se generan espont�neamente o por un tratamiento qu�mico o f�sico. Por ejemplo, una bacteria mutante puede haber perdido la capacidad de alimentarse con cierta sustancia, digamos el az�car galactosa. Esto significa que alg�n gene relacionado con el proceso de asimilaci�n de la galactosa est� alterado. La gen�tica cl�sica operaba con la convicci�n de que hab�a habido un cambio en alg�n lugar del cromosoma bacteriano, precisamente donde se localizaba un gene (una entidad abstracta, para el caso) que deber�a codificar probablemente para una enzima, que quiz� era responsable de catalizar la conversi�n de la galactosa en otra sustancia, m�s adelante en la cadena de asimilaci�n. Desde luego que mediante pruebas indirectas se llegaba a deducir una gran cantidad de informaci�n alrededor de los genes, pero nada pod�a compararse a la posibilidad de observar directamente la secuencia del gene de inter�s. �Qu� podr�amos hacer para aislar este gene? Una vez que se dispone de las t�cnicas de clonaci�n molecular, el proceso es conceptualmente sencillo.

Primero se requiere crear un conjunto de clonas que contengan segmentos de un tama�o adecuado. Lo que se hace es someter una preparaci�n del ADN total de la bacteria en cuesti�n (de la cepa silvestre que contiene el gene normal que nos interesa) a la acci�n de alguna enzima de restricci�n. La reacci�n se controla para generar segmentos de unos 5 a 10 mil pares de bases, cada uno capaz de contener unos cuantos genes. Esta colecci�n de fragmentos se liga a un vector de clonaci�n (v�ase el recuadro II.2) y se introduce a c�lulas de la cepa mutante (la que era incapaz de crecer en galactosa). Si colocamos algunos miles de c�lulas as� transformadas en una caja con medio nutritivo (claro, donde el nutrimento sea galactosa), es probable que crezca alguna de ellas: la que recibi� el segmento que conten�a el gene funcional; correspondiente al gene mutante. Este gene ya no es m�s una entelequia. Se encuentra en un segmento peque�o, insertado en un pl�smido del que se pueden preparar grandes cantidades. Este gene ha sido aislado, o purificado.

En los albores del ADN recombinante, aun este m�todo directo y simple adolec�a de un buen n�mero de dificultades t�cnicas. Desde que se dispon�a de la clona con el gene de inter�s, hasta que se determinaba su secuencia nucleot�dica, pod�an pasar muchos meses. Hoy d�a, el aislamiento y secuenciaci�n de un gene microbiano puede ser una tarea de unas cuantas semanas.

AISLAMIENTO DE GENES USANDO ADN SINT�TICO

Si reflexionamos un momento sobre la t�cnica de complementaci�n anteriormente descrita, observaremos que se requieren dos aspectos cruciales para utilizarla: debemos poder llevar a cabo una transformaci�n (introducci�n estable de genes) del organismo en cuesti�n, y debemos ser capaces de hacer depender su crecimiento de la adquisici�n del gene de inter�s. Estas condiciones no ocurren, ni con mucho, en todos los casos. De hecho, la capacidad de transformar organismos diferentes a E.coli ha sido desarrollada paulatinamente en los �ltimos 15 a�os y, aun cuando esto ya sea posible para muchos organismos, las dificultades que representa y los bajos rendimientos obtenidos hacen poco viable el uso generalizado de este m�todo en el aislamiento de genes.

Se requer�a, dise�ar otras estrategias capaces de localizar los genes. Es claro que, dado que el ADN de todos los organismos tiene la misma naturaleza qu�mica, resulta en principio igual de simple hacer un banco o colecci�n de clonas con el ADN de uno u otro organismo. Una primera diferencia estriba en que, mientras m�s complejo sea el organismo, m�s clonas necesitaremos para representar su genoma o, dicho de otra manera, necesitaremos buscar en muchas m�s clonas para tener una buena probabilidad de encontrar un determinado gene. Una cuenta sencilla nos persuade r�pidamente de las diferencias: si cada clona hecha en un vector de donaci�n simple contiene 5 000 pares de bases, necesitaremos unas 1 000 clonas (o un poco m�s, por razones estad�sticas) para cubrir cinco millones de pares de bases, que es el tama�o aproximado de un genoma microbiano. En cambio, para representar el genoma humano, necesitar�amos cerca de un mill�n de clonas. Para paliar este problema se han desarrollado vectores de clonaci�n, que pueden incorporar cantidades mucho mayores de ADN, indispensables para el estudio de genomas m�s grandes (v�ase el cap�tulo siguiente).

Una vez resuelto el problema de c�mo obtener un n�mero manejable de clonas, �c�mo hacemos para distinguir cu�l de ellas (digamos entre algunos miles) contiene el gene que nos interesa? Una aproximaci�n se apoya en varios conceptos que ya hemos descrito. En primer lugar; sabemos que las prote�nas son codificadas por los genes, y que por mucho tiempo fueron m�s f�ciles de purificar; en realidad, es muy probable que nos interese aislar los genes que codifican para las prote�nas que hemos estudiado durante mucho tiempo. A partir de la secuencia de amino�cidos de una prote�na, se puede inferir la secuencia de ADN que la codifica (aunque de manera aproximada, dada la "degeneraci�n" del c�digo gen�tico). Utilizando este conocimiento se pueden dise�ar oligonucle�tidos sint�ticos cuya secuencia sea complementaria al gene correspondiente. Aqu� entra en juego la asombrosa capacidad de asociaci�n espec�fica de las mol�culas de ADN (descrita en el cap�tulo I, "�cidos nucleicos"). As� que, en principio, utilizando un peque�o segmento de ADN sint�tico (digamos de unas 20 bases), podr�amos hacerlo hibridar con nuestro conjunto de clonas y detectar su asociaci�n espec�fica con el gene que codifica para la prote�na de la cual inferimos su secuencia (v�ase el recuadro III.1).

RECUADRO III.1. Aislamiento de genes usando oligonucle�t�dos sint�ticos As� como existen procedimientos para secuenciar el ADN, tambi�n los hay para secuenciar prote�nas. Los m�todos, que no describiremos en este libro, fueron desarrollados mucho antes que los aplicados al ADN. �Nada menos que por Frederic Sanger! Por este trabajo obtuvo un primer Premio Nobel de qu�mica en 1958. A partir de la secuencia de amino�cidos de una prote�na, podemos deducir la secuencia del ADN que la codifica, utilizando el c�digo gen�tico (en realidad, s�lo de manera imperfecta, debido a que un mismo amino�cido puede ser codificado por m�s de un triplete o cod�n). En todo caso, en ciertas regiones favorables se puede esperar que la secuencia deducida corresponda muy cercanamente a la original. Si se sintetiza un oligo con esta secuencia y se marca radiactivamente, tenemos una sonda o detector que mediante una hibridizaci�n (v�ase en el cap�tulo I, "�cidos nucleicos") nos permite detectar su secuencia complementaria. Cuando se emplea esta sonda, se puede analizar el contenido de las c�lulas de las colonias derivadas de una genoteca (v�ase en el capítulo II, "Concepto de clonaci�n molecular"). Este enfoque es general, dado que a partir de una secuencia de ADN particular se pueden encontrar secuencias asociadas a �sta, sea porque se le parecen mucho o porque son contiguas o se le traslapan. Por ejemplo, se puede dise�ar una sonda con base en la secuencia de un gene de rata para intentar detectar un gene humano. Tambi�n se puede utilizar una sonda cuya secuencia corresponde al extremo de un fragmento donado para detectar otras clonas que tengan esa misma secuencia, pero que se extiendan mas all� de la clona original. /

Esto se ha logrado para un gran n�mero de genes.

En la actualidad, el uso de oligonucle�tidos sint�ticos se ha hecho muy complejo. Muchos genes se a�slan utilizando variantes de la t�cnica b�sica mencionada. La acumulaci�n de datos sobre secuencia de genes de diversos organismos (v�ase el cap�tulo siguiente) permite utilizar un determinado gene de rata para aislar el gene correspondiente humano. En efecto, en muchos casos los genes de especies cercanas, por ejemplo mam�feros, son suficientemente parecidos para hibridizar mutuamente, aunque de manera imperfecta. Asimismo, el empleo de la reacci�n en cadena de polimerasa permite, en muchos casos, obviar inclusive el paso de obtener una biblioteca de genes. �Los genes pueden aislarse, en ocasiones, simplemente amplific�ndolos directamente a partir de una muestra m�nima de material biol�gico!

AISLAMIENTO DE GENES UTILIZANDO ANTICUERPOS

Hemos descrito ya dos m�todos para aislar genes. Quedan todav�a muchos casos en los que las condiciones no son favorables para utilizarlos. Por ejemplo, hay ocasiones en las que la prote�na cuyo gene correspondiente queremos aislar no se puede purificar en gran cantidad. Adem�s, los m�todos para determinar la secuencia de amino�cidos de una prote�na son bastante laboriosos. Afortunadamente, el sistema inmunol�gico nos permite utilizar otro fen�meno de reconocimiento molecular para localizar genes interesantes.

Desde hace muchos a�os, los investigadores del campo de la inmunolog�a han utilizado animales de laboratorio para obtener anticuerpos espec�ficos contra sustancias de inter�s. Las prote�nas, en particular; cuando son extra�as a un animal, inducen en �ste la producci�n de anticuerpos. Estas mol�culas son, a su vez, prote�nas con caracter�sticas muy interesantes (v�ase el cap�tulo siguiente). Baste decir; por el momento, que los anticuerpos pueden ser usados como reactivos que reconocen, en medio de mezclas complejas, las sustancias espec�ficas que indujeron su producci�n. Imaginemos que inyectamos una prote�na de inter�s en un conejo. A partir del suero sangu�neo de este conejo podemos obtener anticuerpos dirigidos contra dicha prote�na. Ahora podemos utilizar estos anticuerpos, de manera an�loga a como se usaron los oligonucle�tidos, para detectar en nuestro banco de donas aquella que contenga el gene que codifica para la prote�na de inter�s.

En este punto quiz� alg�n lector haya detectado un peque�o problema: el ADN de todos los organismos es similar, pero la manera como �ste se expresa para formar prote�nas espec�ficas debe ser muy diferente; de hecho, de la diferencia del control de la expresi�n de los genes deriva en gran parte la diferencia entre unos organismos y otros. En efecto, la biblioteca gen�mica que requerimos utilizar para hacer una "inmunob�squeda", tiene que ser una biblioteca de expresi�n, es decir, una en la que la donaci�n de los genes se realice de tal manera que haya se�ales propias de la c�lula recipiente (normalmente E.col�), que induzcan la transcripci�n y la traducci�n del segmento de ADN clonado.

AISLAMIENTO DE GENES UTILIZANDO SUS ARN MENSAJEROS

Llevamos tres m�todos descritos para el aislamiento de genes. En principio, estas t�cnicas podr�an ser usadas para obtener incluso genes humanos (o para el caso, de cualquier otro organismo superior). Nuevamente, las cosas son m�s complicadas de lo que parecen.

A finales de los a�os setenta, los trabajos pioneros de Phillip Sharp y Richard Roberts sorprendieron a la comunidad cient�fica con un asombroso descubrimiento. Para describir en qu� consisti� lo ins�lito del descubrimiento, antes necesitamos explicar ciertas caracter�sticas de estos experimentos, que ilustran algunos de los m�todos m�s �tiles para aislar genes de organismos complejos. Sharp y Roberts estaban a la caza de un gene de un vertebrado, que codifica para la ovoalb�mina, la prote�na m�s abundante del huevo de gallina. Establecer como meta inicial un gene como �ste tiene una importante raz�n de ser: un gene cuyo producto es el mayoritario en un determinado tejido vivo resulta m�s f�cil de aislar. Esto se debe a que en el tejido respectivo se encuentran abundantes copias del gene en forma de ARN mensajero (v�ase el recuadro I.2). De hecho, si se purifica ARN mensajero del oviducto de gallina, la mayor parte de esta preparaci�n estar� constituida por el mensajero que codifica para la ovoalb�mina. Surge sin embargo un problema: las t�cnicas de clonaci�n reclaman la disponibilidad de ADN, no de ARN, para poder replicar y mantener mol�culas recombinantes. Se hace necesario entonces utilizar un procedimiento que convierta la informaci�n de ARN a ADN. Es decir, que copie una hebra de ARN y la "transcriba", de manera reversa hacia ADN. Esto es, en principio, posible: la informaci�n (codificada en la secuencia) esta en la mol�cula de ARN. Lo que se requiere es una enzima que realice la copia, pero que acepte como molde al ARN, y como nucle�tidos para incorporar a los del ADN. Tal enzima existe en la naturaleza: en los retrovirus (variedad a la que pertenece el virus del SIDA: v�ase el cap�tulo siguiente). Usando una preparaci�n que contenga esta enzima, la transcriptasa reversa, sobre el ARN, se obtiene el llamado ADNc, o ADN complementario. El ADNc puede ser clonado igual que cualquier otro ADN. En el recuadro III.2 se ilustra el proceso de preparaci�n de ADNc.

RECUADRO III.2. Obtenci�n del ADN complementario El procedimiento que permite obtener ADN a partir de ARN es de extrema utilidad. La informaci�n que se encuentra en forma de ARN mensajero es de una complejidad mucho menor a la que se encuentra en el ADN de los cromosomas. El proceso de transcripci�n (v�ase el recuadro I.2) convierte �nicamente una peque�a fracci�n de la informaci�n en ARN, y esta fracci�n expresada corresponde a los genes que son relevantes para la funci�n celular espec�fica del tejido de donde se obtiene el ARN mensajero. Las t�cnicas de ADN recombinante no proveen, sin embargo, la capacidad de donar ARN directamente. Se emplea por lo tanto una t�cnica que utiliza una serie de reacciones enzim�ticas, in vitro, para convertir el ARN mensajero en ADN de doble cadena, listo para ser clonado. El principal componente para lograr este procedimiento es la enzima llamada transcriptasa reversa. Esta enzima es capaz de copiar un molde de ARN para fabricar ADN, agregando las bases complementarias una por una, en un proceso similar a la replicaci�n. Normalmente lo que se desea es copiar s�lo el ARN mensajero, el cual, a su vez se encuentra en la c�lula seguido de una cola de adeninas. Por esto, se agrega un peque�o segmento de ADN constituido por varias timinas, y se logra as� un inicio o cebado de la cadena, espec�fico sobre los mensajeros. Un tratamiento alcalino o enzim�tico permite eliminar el ARN que sirvi� como molde original y se forma luego una segunda hebra de ADN, con lo que se completa la copia clonable.

Ahora s�, estamos en condiciones de describir la sorpresa encontrada por Sharp y Roberts. En efecto, ellos pudieron localizar clonas que conten�an ADN, complementario al mensajero de ovoalb�mina. Una vez disponiendo de este material, pudieron utilizar la propiedad de hibridizaci�n de los �cidos nucleicos para rastrear el gene original a partir de ADN, aislado directamente de los cromosomas. Al comparar las donas de ADNc y de ADN gen�mico se observ� que �stas no coincid�an exactamente. �El ADN gen�mico conten�a segmentos adicionales de ADN, al interior del gene! Estos segmentos se denominaron intrones (v�ase la figura III.1), y subsecuentemente fueron encontrados en casi todos los genes de organismos eucariontes. Este descubrimiento se adicion� a otro concepto ya firmemente establecido por investigaciones anteriores: el genoma de organismos superiores contiene mucho m�s ADN que el necesario para codificar las prote�nas indispensables para la funci�n celular. De hecho, hasta el 95% del ADN de organismos superiores est� constituido por secuencias sin funci�n aparente (v�ase el cap�tulo siguiente).

Podemos comprender entonces que la complejidad de un genoma del ser humano es mucho mayor que la de una bacteria o de una levadura. Aislar genes humanos se parece mucho m�s a buscar una aguja en un pajar. Es por ello que se han desarrollado muy diversos y complejos m�todos, cuya descripci�n rebasa los prop�sitos de este libro, para lograr este objetivo. Claramente, el m�todo del ADNc permite acceder a cualquier gene que se exprese abundantemente en alg�n tejido en particular. El tama�o de una colecci�n representativa de clonas de ADNc ser� siempre mucho menor que el de una colecci�n de clonas derivada directamente del genoma.

En este punto quiz� nos preguntemos: �algunos de los genes m�s interesantes e importantes no podr�an ser de los que se expresan en peque�as cantidades? La respuesta es rotundamente s�, pero aun este tipo de genes se han ido rindiendo a la tenacidad e imaginaci�n de los investigadores. Un ejemplo muy interesante para ilustrar la cacer�a de un gene dif�cil es el caso de aquel cuyo defecto es responsable de la enfermedad llamada fibrosis qu�stica, descrito en la siguiente secci�n.

AISLAMIENTO DE GENES RESPONSABLES DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

Quiz� la mayor�a de nosotros relacionamos el concepto de gen�tica con atributos espec�ficos de personas, animales o plantas, observables directamente. La herencia es evidente en el parecido de los hijos con sus padres, el color de los ojos, cierta marca de la piel, etc. De igual manera, existe un gran n�mero de problemas de salud donde el componente hereditario es muy claro. La presencia de individuos enfermos se correlaciona de manera muy precisa, inclusive predecible, con determinadas familias. Es posible que muchos de nosotros identifiquemos como enfermedades hereditarias algunas de las m�s conocidas: la hemofilia, la enfermedad de Huntington, la anemia falciforme, la fenilcetonuria o la fibrosis qu�stica. Muchas de las enfermedades hereditarias m�s conocidas pueden ser causadas por el defecto de un solo gene. Aunque las t�cnicas cl�sicas de la gen�tica humana podr�an haber establecido este hecho, la posibilidad de identificar el gene preciso, su producto proteico, y la lesi�n causante de la enfermedad, constituyen formidables retos que solo ha sido posible conquistar a partir del surgimiento del ADN recombinante. A la fecha se han identificado las funciones metab�licas defectuosas (es decir, la alteraci�n de la actividad de alguna enzima) para unos 600 de los 3 500 defectos monog�nicos descritos. De muchas de estas enfermedades ya se ha logrado aislar el gene responsable utilizando diversas t�cnicas, incluyendo las antes descritas. En esta secci�n explicaremos de manera m�s precisa lo que se requiri� para obtener el gene responsable de la fibrosis qu�stica.

Esta enfermedad ha sido claramente detallada desde hace m�s de 60 a�os. Su manifiestaci�n cl�nica consiste en la producci�n de sudor muy salado, aunado a deficiencias respiratorias y digestivas. Esta enfermedad se encuentra con bastante frecuencia en ciertas poblaciones humanas, por ejemplo del norte de Europa o entre los estadunidenses de raza negra. Se manifiesta como de caracter autosomal recesivo, lo que quiere decir que afecta por igual a hombres y mujeres, y que se requiere tener los dos genes defectuosos (el paterno y el materno) para que ocurra la enfermedad. En las poblaciones afectadas se puede presentar en uno de cada 25 mil reci�n nacidos. �El gene defectuoso llega a estar en uno de cada 25 individuos! De manera similar al caso de muchas otras enfermedades, el tratamiento de la fibrosis qu�stica consiste en paliar; en la medida de lo posible, la problem�tica asociada. As�, mediante un cuidadoso seguimiento de la dieta, la exploraci�n del t�rax, y otras medidas, se ha podido elevar la calidad de vida de los enfermos. Es claro, sin embargo, que para poder atacar mejor la enfermedad ser�a extremadamente �til conocer su causa �ltima, a nivel molecular. Disponer del gene permitir�a, adem�s, identificar f�cilmente a los portadores asintom�ticos, es decir; a los que tienen s�lo un gene defectuoso (en el cap�tulo V se hace una descripci�n sobre el diagn�stico gen�tico).

Para el caso de otras enfermedades hereditarias, se ha podido recurrir al conocimiento de la funci�n precisa afectada y as� identificar sistemas que expresan abundantemente el gene en cuesti�n, inclusive en otros animales. A partir de estos sistemas es posible obtener ADNc y, eventualmente, aislar el gene. Desafortunadamente, en el caso de la fibrosis qu�stica no exist�a ninguna forma de enriquecer el ARN mensajero correspondiente: no se hab�a logrado identificar la funci�n metab�lica afectada. Un numeroso conjunto de investigadores en varios pa�ses se dieron a la tarea de aislar el gene mediante la t�cnica de clonaci�n posicional. El primer paso en esta t�cnica requiere un an�lisis de asociaci�n entre marcadores gen�ticos previamente establecidos y el gene defectuoso. El trabajo acumulado de muchos a�os ha permitido construir un mapa m�s o menos grueso de diversas marcas, existentes en los cromosomas humanos. Estos mapas se han ido refinando y complicando al utilizar t�cnicas de ADN recombinante y forman una importante base para los esfuerzos que desembocar�n finalmente en la secuenciaci�n completa del genoma humano (v�ase el cap�tulo V). Mientras este objetivo no se haya logrado, se requiere utilizar la informaci�n fragmentaria disponible para identificar genes espec�ficos de gran inter�s. El an�lisis de asociaci�n se lleva a cabo utilizando muestras de ADN de numerosos pacientes afectados por la fibrosis qu�stica, as� como de sus familiares. Se puede inferir que aquellos marcadores que se heredan simult�neamente con la fibrosis qu�stica est�n asociados f�sicamente con �sta (es decir; en el mismo cromosoma y cerca del gene). Esta asociaci�n f�sica indic� que el gene de la fibrosis qu�stica se encontraba en el brazo largo del cromosoma 7, entre los marcadores denominados MET y D7S8. La tenaz y laboriosa b�squeda de varios a�os empezaba a rendir frutos. La aguja ya no se encontraba en un pajar; s�lo en una carretilla de paja: �los marcadores identificaban un segmento de cromosoma de alrededor de un mill�n y medio de pares de bases Este segmento tiene menos del 1% de la longitud del cromosoma 7, pero todav�a es demasiado largo; en �l caben muchos genes y mucho ADN espaciador (podemos notar que un segmento de este tama�o es equivalente a un tercio del genoma de una bacteria como E.coli). En pasos subsiguientes se identificaron sistem�ticamente clonas pertenecientes a esta regi�n del cromosoma 7. Mediante ingeniosas t�cnicas denominadas saltos y caminados cromosomales, despu�s de varios meses de intenso trabajo se logr� identificar el gene. En el proceso tambi�n fue necesario emplear ADN de bovino, ratones, cuyos y pollos, donde se infer�a, con base en criterios evolutivos, que deb�a existir un gene similar, pero no sus secuencias adyacentes. Finalmente, se solidific� la inferencia de que el gene identificado era el que se buscaba al localizar una clona de ADNc, obtenida de gl�ndulas sudor�paras, que hibridizaba con la regi�n definida mediante el an�lisis posicional. El gene de la fibrosis qu�stica se encuentra distribuido en 250,000 pares de bases, constituido por 24 exones y codifica para una prote�na de 1480 amino�cidos.

Esta notable muestra de la investigaci�n gen�tica molecular moderna nos permiti� ejemplificar los procedimientos desarrollados para lograr el aislamiento de genes particularmente elusivos. En cap�tulos subsiguientes describiremos algunas de las muchas cosas que pueden hacerse cuando se dispone de genes aislados, incluyendo los nuevos conocimientos y alternativas posibles para la terapia de la fibrosis qu�stica.