Muchas expediciones militares emprendidas por los españoles desde el siglo XVI para descubrir y someter nuevos territorios y poblaciones incorporaron a sus filas a numerosos guerreros tlaxcaltecas. Algunos decidieron voluntariamente quedarse a vivir en los pueblos recién conquistados, y otros lo hicieron obligados por las circunstancias; pocos de ellos llegaron ahí con todo y sus familias, y muchos formaron las propias con gente del lugar; una minoría pudo o quiso regresar a su tierra natal. Así, indios naturales de Tlaxcala se asentaron, por ejemplo, en diversos lugares de Centroamérica, en lo que actualmente son los países de Guatemala, Honduras y El Salvador, o en zonas del occidente y el noroeste de México, así como en el sur de lo que hoy es Estados Unidos de Norteamérica. Pero quizá más numerosos que estos aislados "transterrados" fueron aquellos otros que salieron de Tlaxcala en grandes grupos para colonizar pacíficamente ciertas regiones de la Nueva España, por medio de asentamientos organizados y designados por el gobierno virreinal. El más importante de estos casos fue el de la colonización de la Gran Chichimeca.
Con motivo del descubrimiento de las minas de plata en la región norteña a mediados del siglo XVI, y debido a los violentos enfrentamientos sostenidos entre las milicias españolas y los indios seminómadas que habitaban aquellos lugares (denominados con el genérico de chichimecas), el gobierno virreinal vio la necesidad de establecer rutas de comunicación y asentamientos estratégicos para conseguir el dominio y explotación de esa zona. Los primeros en abrir camino fueron los soldados, algunos misioneros y un grupo de indios otomíes; pero entonces los poblamientos a duras penas fueron más-allá de los "presidios" o fuertes militares construidos para defenderse de los terribles ataques chichimecas. En 1560 se hizo un primer intento por llevar allá un contingente de mil familias tlaxcaltecas, pero el cabildo de Tlaxcala no aceptó, puesto que no estaban claras las condiciones del traslado, lo cual hacía temer que esa gente podría perder los privilegios concedidos a la provincia toda vez que hubiera emigrado de ahí.
En virtud de que la guerra chichimeca se prolongó por más de 30 años, el siguiente proyecto de poblamiento tlaxcalteca en el norte no se dio sino hasta 1591, cuando algunos tratados de paz ya empezaban a producir tranquilidad en aquella zona bárbara. En ese año, el virrey Luis de Velasco II pactó con el cabildo de Tlaxcala un acuerdo en el que se establecían las condiciones del traslado de 400 familias para ayudar en la "civilización" de la Gran Chichimeca. Los nuevos asentamientos tlaxcaltecas estarían totalmente separados de las poblaciones españolas y de otros grupos indígenas; contarían con autonomía política y conformarían un gobierno propio sujeto sólo a la autoridad del virrey; los colonos serían exentados de cualquier tipo de tributo o servicio personal; mantendrían todos los privilegios concedidos y por conceder a la provincia de Tlaxcala, y los bienes que en ella dejaran les serían amparados; las nuevas tierras que les fueran otorgadas en forma privada o comunal no les podrían ser enajenadas bajo ningún concepto; y en cuestión religiosa dependerían sólo de los misioneros franciscanos. Además de estas prerrogativas se les proporcionaría ropa, alimentos y transporte para realizar el largo viaje, algunos instrumentos de labranza y ciertos recursos para garantizar su sustento durante los dos años iniciales.
Los primeros días de junio de 1591 partieron de Tlaxcala cuatro caravanas presididas por ocho cacique-capitanes, dos por cada una de las cuatro cabeceras: Ocotelulco, Tizatlán, Quiahuiztlán y Tepeticpac. Ninguna de ellas pudo reunir las cien familias que le correspondían, ni siquiera incorporando a algunos presos liberados para tal objetivo. Se calcula que salieron alrededor de 345 familias en vez de 400, aun cuando la tradición ha preferido mantener como cierta esta última cifra. Tal vez el gobierno virreinal no quiso esperar a que se reuniera la cantidad pactada, pues ya empezaba a haber algunas disidencias entre los capitanes comprometidos a partir, los cuales fueron castigados para evitar que cundiera el mal ejemplo. Poco tiempo después de iniciado el viaje de las caravanas fueron multiplicándose los asentamientos esperados. Colonias de tlaxcaltecas surgieron en lo que más tarde serían los estados de San Luis Potosí, Zacatecas, Durango y Coahuila. Muchas de las nuevas poblaciones dejaron en sus nombres: "Tlaxcalilla" o "Nueva Tlaxcala", la impronta de sus fundadores. La antigua Tlaxcallan ramificó, así, su cultura y sus privilegios por diversas partes de la Nueva España, aunque con el paso del tiempo la cultura se mezcló con la de otros pueblos y los privilegios fueron olvidados por las autoridades.
Las sucesivas emigraciones en las que fueron embarcados muchos tlaxcaltecas no hubieran sido razón suficiente para provocar el enorme despoblamiento que tuvo la provincia de Tlaxcala hacia fines del siglo XVI. A esa crisis demográfica contribuyó con mayor intensidad otro factor: la inmensa cantidad de tlaxcaltecas que murieron por diversos motivos.
A lo largo de ese siglo, más de media docena de fuertes epidemias de viruela, sarampión, peste y otras enfermedades traídas a América por los europeos asolaron a esta provincia, así como a otras muchas partes de la Nueva España. La gran cantidad de muertos que dejaba cada una de tales epidemias incidía en una fuerte reducción de los cultivos, también afectados por las periódicas crisis agrícolas provocadas por los fenómenos meteorológicos y las plagas. El descenso en la producción de alimentos propició sucesivas hambrunas, que también cobraron su buena cuota de víctimas. Al aumento en el número de muertes contribuyeron igualmente las guerras sostenidas por los tlaxcaltecas, primero contra los españoles, y luego al lado de éstos en la conquista de Tenochtitlan, en la de otros señoríos del imperio mexica y de muchos pueblos más distantes. Se calcula que para finales del siglo XVI la población de Tlaxcala se había reducido 85% en relación con la que existía a la llegada de los españoles. De cerca de 500 000 habitantes se había pasado a menos de 100 000.
El intenso avance del despoblamiento hizo inevitable que entre los siglos XVI y XVII ciertos pueblos tlaxcaltecas se extinguieran y surgieran otros; que algunos crecieran en número de barrios y de habitantes, mientras que otros padecían bajas en sus listas de tributarios. Por lo general, las regiones más afectadas por el despoblamiento fueron las que se encontraban más alejadas de los afluentes de agua y, por consiguiente, con una producción agrícola más precaria.
Para evitar que las tierras abandonadas por los indígenas fueran ocupadas por los españoles, según lo permitía un mandato virreinal, el cabildo de Tlaxcala dispuso que dichas tierras pasaran a formar parte de los bienes de comunidad que el mismo cabildo ya detentaba. Y con el propósito de hacer efectiva tal posesión, el mismo organismo proporcionó instrumentos de labranza y mano de obra para que se trabajasen en común, y metió a pastar manadas de ovejas en los terrenos ya enzacatados. Sin embargo, para finales del siglo XVI, cuando el despoblamiento de Tlaxcala alcanzó niveles muy considerables, el cabildo ya no pudo conservar para sí tantas tierras incultas, por lo que, contra su voluntad, se vio obligado a venderlas a labradores españoles.
Debido a que el proceso de despoblamiento que estaba sufriendo la provincia de Tlaxcala era patente, el cabildo indígena tuvo que aceptar de las autoridades virreinales que se llevaran a cabo algunas "congregaciones", o sea la reubicación de asentamientos con escasa población, al mismo tiempo que se realizaban los acuerdos de colonización de la Gran Chichimeca. Ya en 1560 se había intentado hacer congregación en Tlaxcala ante la primera ola de aguda crisis demográfica. Entonces el cabildo apoyado por los frailes franciscanos, había expuesto su preocupación de que dichas congregaciones pudieran afectar los privilegios del propio cabildo y de los antiguos señoríos indígenas con respecto a sus pueblos sujetos o tributarios, y de que el reacomodo de los espacios habitados no coincidiera con las jurisdicciones de doctrina establecidas por los misioneros. Esta defensa de sus derechos como pueblo realengo, sostenida en aquel momento y después, provocó que las congregaciones en Tlaxcala se postergaran por varias décadas y que las efectuadas posteriormente no tuvieran el peso que alcanzaron en otras partes de la Nueva España.
