Muchas expediciones militares emprendidas por los espa�oles desde el siglo XVI para descubrir y someter nuevos territorios y poblaciones incorporaron a sus filas a numerosos guerreros tlaxcaltecas. Algunos decidieron voluntariamente quedarse a vivir en los pueblos reci�n conquistados, y otros lo hicieron obligados por las circunstancias; pocos de ellos llegaron ah� con todo y sus familias, y muchos formaron las propias con gente del lugar; una minor�a pudo o quiso regresar a su tierra natal. As�, indios naturales de Tlaxcala se asentaron, por ejemplo, en diversos lugares de Centroam�rica, en lo que actualmente son los pa�ses de Guatemala, Honduras y El Salvador, o en zonas del occidente y el noroeste de M�xico, as� como en el sur de lo que hoy es Estados Unidos de Norteam�rica. Pero quiz� m�s numerosos que estos aislados "transterrados" fueron aquellos otros que salieron de Tlaxcala en grandes grupos para colonizar pac�ficamente ciertas regiones de la Nueva Espa�a, por medio de asentamientos organizados y designados por el gobierno virreinal. El m�s importante de estos casos fue el de la colonizaci�n de la Gran Chichimeca.
Con motivo del descubrimiento de las minas de plata en la regi�n norte�a a mediados del siglo XVI, y debido a los violentos enfrentamientos sostenidos entre las milicias espa�olas y los indios semin�madas que habitaban aquellos lugares (denominados con el gen�rico de chichimecas), el gobierno virreinal vio la necesidad de establecer rutas de comunicaci�n y asentamientos estrat�gicos para conseguir el dominio y explotaci�n de esa zona. Los primeros en abrir camino fueron los soldados, algunos misioneros y un grupo de indios otom�es; pero entonces los poblamientos a duras penas fueron m�s-all� de los "presidios" o fuertes militares construidos para defenderse de los terribles ataques chichimecas. En 1560 se hizo un primer intento por llevar all� un contingente de mil familias tlaxcaltecas, pero el cabildo de Tlaxcala no acept�, puesto que no estaban claras las condiciones del traslado, lo cual hac�a temer que esa gente podr�a perder los privilegios concedidos a la provincia toda vez que hubiera emigrado de ah�.
En virtud de que la guerra chichimeca se prolong� por m�s de 30 a�os, el siguiente proyecto de poblamiento tlaxcalteca en el norte no se dio sino hasta 1591, cuando algunos tratados de paz ya empezaban a producir tranquilidad en aquella zona b�rbara. En ese a�o, el virrey Luis de Velasco II pact� con el cabildo de Tlaxcala un acuerdo en el que se establec�an las condiciones del traslado de 400 familias para ayudar en la "civilizaci�n" de la Gran Chichimeca. Los nuevos asentamientos tlaxcaltecas estar�an totalmente separados de las poblaciones espa�olas y de otros grupos ind�genas; contar�an con autonom�a pol�tica y conformar�an un gobierno propio sujeto s�lo a la autoridad del virrey; los colonos ser�an exentados de cualquier tipo de tributo o servicio personal; mantendr�an todos los privilegios concedidos y por conceder a la provincia de Tlaxcala, y los bienes que en ella dejaran les ser�an amparados; las nuevas tierras que les fueran otorgadas en forma privada o comunal no les podr�an ser enajenadas bajo ning�n concepto; y en cuesti�n religiosa depender�an s�lo de los misioneros franciscanos. Adem�s de estas prerrogativas se les proporcionar�a ropa, alimentos y transporte para realizar el largo viaje, algunos instrumentos de labranza y ciertos recursos para garantizar su sustento durante los dos a�os iniciales.
Los primeros d�as de junio de 1591 partieron de Tlaxcala cuatro caravanas presididas por ocho cacique-capitanes, dos por cada una de las cuatro cabeceras: Ocotelulco, Tizatl�n, Quiahuiztl�n y Tepeticpac. Ninguna de ellas pudo reunir las cien familias que le correspond�an, ni siquiera incorporando a algunos presos liberados para tal objetivo. Se calcula que salieron alrededor de 345 familias en vez de 400, aun cuando la tradici�n ha preferido mantener como cierta esta �ltima cifra. Tal vez el gobierno virreinal no quiso esperar a que se reuniera la cantidad pactada, pues ya empezaba a haber algunas disidencias entre los capitanes comprometidos a partir, los cuales fueron castigados para evitar que cundiera el mal ejemplo. Poco tiempo despu�s de iniciado el viaje de las caravanas fueron multiplic�ndose los asentamientos esperados. Colonias de tlaxcaltecas surgieron en lo que m�s tarde ser�an los estados de San Luis Potos�, Zacatecas, Durango y Coahuila. Muchas de las nuevas poblaciones dejaron en sus nombres: "Tlaxcalilla" o "Nueva Tlaxcala", la impronta de sus fundadores. La antigua Tlaxcallan ramific�, as�, su cultura y sus privilegios por diversas partes de la Nueva Espa�a, aunque con el paso del tiempo la cultura se mezcl� con la de otros pueblos y los privilegios fueron olvidados por las autoridades.
Las sucesivas emigraciones en las que fueron embarcados muchos tlaxcaltecas no hubieran sido raz�n suficiente para provocar el enorme despoblamiento que tuvo la provincia de Tlaxcala hacia fines del siglo XVI. A esa crisis demogr�fica contribuy� con mayor intensidad otro factor: la inmensa cantidad de tlaxcaltecas que murieron por diversos motivos.
A lo largo de ese siglo, m�s de media docena de fuertes epidemias de viruela, sarampi�n, peste y otras enfermedades tra�das a Am�rica por los europeos asolaron a esta provincia, as� como a otras muchas partes de la Nueva Espa�a. La gran cantidad de muertos que dejaba cada una de tales epidemias incid�a en una fuerte reducci�n de los cultivos, tambi�n afectados por las peri�dicas crisis agr�colas provocadas por los fen�menos meteorol�gicos y las plagas. El descenso en la producci�n de alimentos propici� sucesivas hambrunas, que tambi�n cobraron su buena cuota de v�ctimas. Al aumento en el n�mero de muertes contribuyeron igualmente las guerras sostenidas por los tlaxcaltecas, primero contra los espa�oles, y luego al lado de �stos en la conquista de Tenochtitlan, en la de otros se�or�os del imperio mexica y de muchos pueblos m�s distantes. Se calcula que para finales del siglo XVI la poblaci�n de Tlaxcala se hab�a reducido 85% en relaci�n con la que exist�a a la llegada de los espa�oles. De cerca de 500 000 habitantes se hab�a pasado a menos de 100 000.
El intenso avance del despoblamiento hizo inevitable que entre los siglos XVI y XVII ciertos pueblos tlaxcaltecas se extinguieran y surgieran otros; que algunos crecieran en n�mero de barrios y de habitantes, mientras que otros padec�an bajas en sus listas de tributarios. Por lo general, las regiones m�s afectadas por el despoblamiento fueron las que se encontraban m�s alejadas de los afluentes de agua y, por consiguiente, con una producci�n agr�cola m�s precaria.
Para evitar que las tierras abandonadas por los ind�genas fueran ocupadas por los espa�oles, seg�n lo permit�a un mandato virreinal, el cabildo de Tlaxcala dispuso que dichas tierras pasaran a formar parte de los bienes de comunidad que el mismo cabildo ya detentaba. Y con el prop�sito de hacer efectiva tal posesi�n, el mismo organismo proporcion� instrumentos de labranza y mano de obra para que se trabajasen en com�n, y meti� a pastar manadas de ovejas en los terrenos ya enzacatados. Sin embargo, para finales del siglo XVI, cuando el despoblamiento de Tlaxcala alcanz� niveles muy considerables, el cabildo ya no pudo conservar para s� tantas tierras incultas, por lo que, contra su voluntad, se vio obligado a venderlas a labradores espa�oles.
Debido a que el proceso de despoblamiento que estaba sufriendo la provincia de Tlaxcala era patente, el cabildo ind�gena tuvo que aceptar de las autoridades virreinales que se llevaran a cabo algunas "congregaciones", o sea la reubicaci�n de asentamientos con escasa poblaci�n, al mismo tiempo que se realizaban los acuerdos de colonizaci�n de la Gran Chichimeca. Ya en 1560 se hab�a intentado hacer congregaci�n en Tlaxcala ante la primera ola de aguda crisis demogr�fica. Entonces el cabildo apoyado por los frailes franciscanos, hab�a expuesto su preocupaci�n de que dichas congregaciones pudieran afectar los privilegios del propio cabildo y de los antiguos se�or�os ind�genas con respecto a sus pueblos sujetos o tributarios, y de que el reacomodo de los espacios habitados no coincidiera con las jurisdicciones de doctrina establecidas por los misioneros. Esta defensa de sus derechos como pueblo realengo, sostenida en aquel momento y despu�s, provoc� que las congregaciones en Tlaxcala se postergaran por varias d�cadas y que las efectuadas posteriormente no tuvieran el peso que alcanzaron en otras partes de la Nueva Espa�a.
