Las villas de San Miguel y San Felipe, en el camino entre Querétaro y Zacatecas, no fueron las únicas que se fundaron para proteger a los españoles, aunque dieron pie al descubrimiento del mineral de Guanajuato y la construcción de los fuertes de Marfil y Tepetapa. Antes de la conquista, la villa de San Felipe fue ranchería de chichimecas; los españoles que comenzaron a avecindarse fueron asesinados. La villa fue cercada con un muro hacia 1570 por órdenes del virrey Enríquez de Almanza, quien a su vez fundó la población de la Concepción de Celaya.
Destaca la labor evangélica de los agustinos fray Rodrigo Hernández, que tenía especial inclinación por los indios insurrectos, y fray Guillermo de Santa María, que solía internarse por temporadas hasta 30 o 40 leguas al norte de San Felipe y se valía de la lengua tarasca, gracias a algunos chichimecas que también la hablaban, para tratar con los rebeldes. Se dice que a los guachichiles de San Felipe les trazó las calles en el pueblo o sitio que llaman de San Francisco, que probablemente es el Valle de San Francisco (actual de Villa de Reyes), hasta donde llegaba la jurisdicción de la justicia de San Felipe. En este Valle de San Francisco se hizo un fuerte.
Otros fuertes se hicieron en el Portezuelo y Ojuelos. El capitán Juan Domínguez, que anduvo todo el norte de 1569 a 1609, fundó los fuertes de Bocas, Ciénega Grande y Palmillas.
El doctor Jerónimo de Orozco, gobernador y presidente de la Nueva Galicia a partir de diciembre de 1572, recibió la comisión real que le encargaba poblar adecuadamente la región de la frontera. Al poco tiempo, fundó la villa de la Asunción de Aguascalientes.
A fines de marzo de 1563 se pobló Santa María de los Lagos en los llanos de los zacatecas.
Fray Diego de la Magdalena, natural de Extremadura, pasó a la Nueva España siendo muy niño, con el ánimo de adquirir riquezas, pero fue al monasterio de San Francisco de la ciudad de México a pedir el hábito para lego. Apenas profesó, le hicieron limosnero de la ciudad, pero al tener noticia de las depredaciones de los guachichiles pidió licencia para ir a evangelizar esta zona.
Comenzó la labor de evangelización entre los chichimecas alrededor de 1554, según las noticias que proporciona el padre Arlegui; sin embargo, tenemos muy poca información al respecto. Se sabe que murió de 95 años; pasó más de 35 o 40 entre los chichimecas y alrededor de 20 de ellos con los guachichiles. Los indígenas siempre huían hacia el norte, y allá fue fray Diego, al país de los zacatecas que, acosados por otras tribus, no sólo hicieron buen acogimiento a los primeros españoles, sino que ayudaron a la expedición de Juan de Tolosa. Caminando al oriente, descubrió las salinas de Santa María, que supo aprovechar de inmediato para el laboreo de las minas. De allí a la sierra de Charcas no había más que un paso; sin embargo, los españoles tardaron todavía un cuarto de siglo en darlo, y hubieran tardado más de no contar con el auxilio de fray Diego, que anduvo por esta región evangelizando a los chichimecas de ranchería en ranchería, en Charcas, Venado y en las Salinas. De las dificultades de la empresa dio muestra el convento de Charcas, fundado en 1574 y que casi de inmediato fue reducido a cenizas por los chichimecas. Fue reedificado en 1582 por los misioneros, auxiliados por Juan de Oñate, que entró en son de conquista y descubrió aquellas minas.
Fray Diego anduvo cerca de un año, el de 1582, entre los indios yumanos que habitaban al norte de la Gran Chichimeca, en pueblos trazados con buen orden y en casas con azotea y de cal y canto. De 1583 en adelante fray Diego entró resueltamente en la Guachichila, hasta los sitios que se indicaban como los mas peligrosos, donde después se fundó San Miguel Mexquitic y se descubrieron las minas del Potosí. En tales lugares, como en Armadillo, San Luis de la Paz y Xichú, que caían en los términos de la misma nación, su celo apostólico alcanzó a apaciguar a los guachichiles. Luego trató de formar congregaciones, empezando por la de San Luis, donde procuró fundar doctrina. Arlegui afirma que en 1583 se erigió en San Luis el convento franciscano con dos religiosos, pero como en otro lugar de su obra dice que el convento data de 1590, se debe entender que la primera fecha fue la del hospicio. De todas maneras, ya desde 1583 hubo sacerdotes franciscanos en la congregación indígena de San Luis, entre los que se cuenta fray Juan de Ayala.
A pesar de la conversión de algunos guachichiles, los que rehusaron congregarse renovaron su violencia, así contra los indios sometidos como contra los españoles. En 1583, el Capitán Miguel Caldera reclutó soldados indios de la jurisdicción de Juchipila para combatir, como lo hizo durante más de cinco años, a los guachichiles rebeldes de San Luis y Tequisquiapan; éstos probablemente se retiraron hacia Charcas y el Venado. Para evitar su regreso, se levantó el fuerte de las Bocas de Maticoya que servía como contención.
Gracias al descubrimiento de las minas de Charcas, se repobló aquel lugar, llamado Real de Navidad y con el consentimiento de todo el vecindario se señalaron asientos y solares para un monasterio de franciscanos. Entre los primeros sacerdotes del lugar se encuentra fray Sebastián del Castillo.
Después de 1582 se levantó un presidio en el Valle de San Francisco, que quedó a cargo del capitán Miguel Caldera. Entre 1584 y 1585 se estableció un fuerte en las minas de Charcas.
En esta época se conocieron fray Diego de la Magdalena y el capitán Caldera cuando, vencidos ya los guachichiles, logró que se abrazaran en Juchipila con los indios de Meca Tabasco, contra quienes habían peleado. Caldera trajo a los guachichiles a los puestos de San Luis y Tequisquiapan, establecidos gracias a los afanes de fray Diego.
Hacia 1590, pacificada toda la nación guachichil, fray Diego reunió a los capitanes indios en el puesto de San Luis para ir con ellos a México en compañía de Caldera. El virrey Luis de Velasco determinó que los indios tlaxcaltecas vivieran con los guachichiles para que los convirtieran a la fe católica y al trabajo. Aunque poblaron juntos, nunca se mezclaron.
En el puesto de Santa María del Río vivió algun tiempo fray Diego de la Magdalena consagrado, la mayor parte del tiempo, a la penitencia. Aunque murió en el convento de San Luis, pasó sus últimos años en Tlaxcalilla, entregado a la oración y a enseñar la doctrina a los niños tlaxcaltecas y a los guachichiles de Santiago.
Una de la últimas fundaciones del siglo es la del pueblo de Santa María del Río, el 10 de febrero de 1592, por merced hecha a Alonso de Santa María del Río, hijo del conquistador Juan de Santa María, y a los indios de Santa María del Río de la frontera chichimeca del partido de San Luis Potosí. Sin embargo, a pesar de la precisión del dato, se ha establecido que el asentamiento definitivo de otomíes y chichimecas en el poblado de Santa María que originalmente ocuparon no se hizo sino hasta 1610.
