VIII. C�MO SE ESTUDIAN LAS MEMBRANAS
DURANTE muchos a�os esencialmente se hicieron estudios en membranas celulares naturales obtenidas por diferentes procedimientos. Uno de los m�todos tal vez m�s antiguos que exista es el de la preparaci�n de membranas de gl�bulos rojos. La t�cnica para obtenerlas es muy sencilla; simplemente se colocan estos corp�sculos sangu�neos en una soluci�n muy diluida de algunas sales, y debido a la presi�n osm�tica (v�ase el Cap�tulo VII), se rompe su membrana y el contenido escapa al exterior. Sin embargo, si el procedimiento se realiza en condiciones especiales, las membranas vuelven a sellarse y pueden separarse luego por centrifugaci�n. Estas membranas se ven transparentes al microscopio por haber perdido su color y se les denomina "fantasmas" de eritrocitos.
Por diferentes procedimientos ha sido posible preparar membranas naturales de muchos otros or�genes, tanto de las c�lulas como de diferentes componentes u organelos. Pero hace aproximadamente 20 a�os se iniciaron estudios utilizando membranas llamadas "artificiales", debido a que no proven�an directamente de las c�lulas. Su nombre en realidad no est� bien aplicado, pues los fosfol�pidos, a partir de los cuales se forman, s� se extraen, ya sea de c�lulas o de otros sistemas biol�gicos.
Si se quieren hacer estudios sobre la composici�n de las membranas es necesario aislarlas, pero cuando se trata de conocer su funcionamiento, se pueden utilizar desde c�lulas enteras o tejidos hasta componentes intracelulares, como pueden ser las mitocondrias, lisosomas, ret�culo sarcopl�smico, etc. De cualquier manera, ya sea que se trate de hacer los estudios en c�lulas u organelos aislados, los pasos para obtener una y otras preparaciones implican primero la separaci�n de los componentes, ya sean las c�lulas de los tejidos, los organelos de las c�lulas, o bien las membranas mismas obtenidas de diferentes partes de las c�lulas o sus organelos.
Para obtener los componentes de un tejido (Figura 54), el procedimiento inicial
m�s com�n que existe es disgregarlos. As�, por ejemplo, si se busca obtener
c�lulas enteras, lo que se hace con frecuencia es utilizar alg�n producto capaz
de digerir el material intercelular que las mantiene unidas. Para separar c�lulas
hep�ticas, por ejemplo, se utiliza una enzima llamada colagenasa, que permite
la separaci�n de las c�lulas.
Figura 54. Diagrama general sobre la separaci�n de los componentes celulares.
Si lo que se trata de separar son las mitocondrias u otros componentes intracelulares, a lo que se debe recurrir es a diferentes procedimientos de ruptura de las c�lulas, que en la jerga de laboratorio reciben el nombre de homogeneizaci�n. Los procedimientos son diversos seg�n la c�lula de que se trate, pero uno de los m�s frecuentes consiste en el empleo del homogeneizador, que es un tubo de vidrio en cuyo interior se colocan las c�lulas o fragmentos del tejido que se desea homogeneizar. A continuaci�n, al tiempo que se le imprimen movimientos hacia dentro y hacia fuera, se hace girar en su interior un v�stago que puede ser de vidrio o de tefl�n, que termina por remoler a las c�lulas, dejando intactos a algunos de sus componentes, como n�cleos, mitocondrias, lisosomas, ret�culo sarcopl�smico, etc. Pero tambi�n se pueden utilizar otros sistemas, como licuadoras, semejantes a las que se emplean para preparar alimentos, la agitaci�n con perlas de vidrio o abrasivos, la vibraci�n ultras�nica, la compresi�n y descompresi�n u otros aparatos.
Hay c�lulas como las de algunos microorganismos o plantas que tienen una pared celular que no es tan f�cil de romper, y para preparar o separar los componentes intracelulares deben utilizarse procedimientos un tanto mas dr�sticos. Para el efecto se han dise�ado diferentes instrumentos, cuyo funcionamiento no viene al caso discutir en este momento. Tambi�n se utilizan enzimas capaces de digerir la pared celular antes de romper las c�lulas.
M�TODOS DE SEPARACI�N DE LOS ORGANELOS SUBCELULARES
Existen muchos m�todos, pero uno de los m�s utilizados en el laboratorio consiste en separar los distintos componentes de las c�lulas, o las c�lulas mismas, aprovechando sus diferentes densidades, y el hecho de que, por lo tanto, la velocidad con que sedimentan los distintos componentes var�a de acuerdo con esa densidad.
La figura 55 muestra en forma simplificada el procedimiento que puede utilizarse
para separar los componentes de una c�lula, y que consiste esencialmente en
dos sistemas; en el m�s usado de ellos, llamado de centrifugaci�n diferencial,
se realizan centrifugaciones a distintas velocidades y tiempos para obtener
sus componentes. Por ejemplo, para sedimentar las mitocondrias de c�lulas hep�ticas
basta con centrifugar alrededor de 10 minutos el homogeneizado a una velocidad
que produzca algo as� como 8 000 veces la fuerza de la gravedad. Pero antes
de eso, ser� necesario sedimentar part�culas m�s pesadas como los n�cleos. Entonces,
lo que se hace primero es centrifugar a una velocidad menor y despu�s sedimentar
las mitocondrias. Si lo que se trata de obtener son los ribosomas de las c�lulas,
es necesario centrifugar durante aproximadamente 30 minutos a una velocidad
que genere algo as� como 100 000 veces la fuerza de la gravedad.
Figura 55. La sedimentaci�n de componentes celulares por centrifugaci�n.
Otro de los procedimientos consiste en la preparaci�n en un tubo de centr�fuga de una soluci�n que puede ser de sacarosa o de otras sustancias, en la cual la concentraci�n de la sustancia disuelta va aumentando de arriba a abajo en el tubo. Esto equivale a que existan entonces diferentes densidades a distinta altura. Si luego se coloca un homogeneizado o una preparaci�n un poco m�s pura obtenida de alguna c�lula, y se le somete a una centrifugaci�n, cada una de las part�culas presentes en el homogeneizado se va a detener en el punto en donde la densidad del l�quido sea igual a la propia. As�, los n�cleos viajar�n hacia la parte inferior del tubo, las mitocondrias se quedar�n en una zona intermedia por arriba de la anterior, y los ribosomas en una zona todav�a m�s arriba.
El procedimiento que se llama de centrifugaci�n en un gradiente de concentraci�n, en ocasiones permite separar componentes celulares que tienen densidades relativamente semejantes.
Como ya se mencion�, las propiedades de las membranas de las part�culas subcelulares pueden estudiarse utiliz�ndolas intactas; se pueden realizar los experimentos directamente con las part�culas obtenidas en la centrifugaci�n. Sin embargo, si lo que se busca es conocer m�s detalladamente las propiedades de las membranas, y en especial sus componentes, es necesario en principio utilizar un procedimiento semejante al ya mencionado para la preparaci�n de las membranas de los gl�bulos rojos; el procedimiento consiste en la ruptura de las membranas y su separaci�n posteriormente, casi siempre por centrifugaci�n diferencial. En todos los casos, cuando se hace la ruptura, cambian las densidades respecto a las c�lulas u organelos intactos, y las velocidades de centrifugaci�n y los tiempos utilizados tienen que ser m�s largos.
Las t�cnicas para la separaci�n de los componentes celulares y sus membranas han evolucionado a tal grado, que ya en esta �poca es posible obtener una preparaci�n de membranas puras de pr�cticamente cualquier sistema biol�gico.
AN�LISIS DE LOS COMPONENTES DE LAS MEMBRANAS
Los l�pidos. Para estudiar la composici�n lip�dica de una membrana, el m�todo en general simplemente aprovecha las propiedades de solubilidad de los l�pidos, y dado que algunos son m�s o menos solubles en ciertos l�quidos o solventes, seg�n la membrana, se utilizan extracciones; es decir, la solubilizaci�n de los l�pidos usando distintos tipos de solventes o mezclas de ellos como cloroformo, alcohol met�lico, hexano, acetona, etc�tera.
Despu�s de la extracci�n de los l�pidos suele procederse a su separaci�n e
identificaci�n. Para ello hay un n�mero enorme de t�cnicas, mediante las cuales
se pueden separar los componentes, pero probablemente el m�s utilizado sea la
separaci�n por cromatograf�a, ya sea en una placa o en una columna. La Figura
56 muestra en forma esquem�tica el principio de la cromatograf�a. Tanto para
los l�pidos, como para otras sustancias, se les puede colocar ya sea en una
placa recubierta de un material especial o en una columna o tubo de vidrio lleno
con el material que se desea analizar. Por sus propiedades de solubilidad y
carga, las mol�culas se fijan con diferente fuerza a las part�culas de la sustancia
que se ha utilizado para preparar la placa o la columna. Entonces se procede
a pasar una corriente de alg�n solvente o mezclas de solventes que arrastran
con distinta velocidad a los componentes que se han colocado en el sistema.
Debido a estas velocidades diferentes, las diversas mol�culas se separan formando
bandas o manchas que pueden detectarse utilizando colorantes, oxidantes o simplemente
por calentamiento a temperaturas altas.
Figura 56. Esquema de dos tipos de cromatograf�a para separar mezclas de sustancias.
El empleo de las columnas de cromatograf�a permite no solamente la separaci�n de las sustancias, sino eventualmente aislarlas en cantidades m�s importantes. Una vez que se cuenta con cantidades adecuadas de una sustancia, los procedimientos son muy variados. Hay un gran n�mero de m�todos anal�ticos que pueden ser m�s o menos complicados, que finalmente pueden llevar a definir su estructura.
Las prote�nas. Los procedimientos empleados para estudiar o aislar,
inclusive purificar las prote�nas de las membranas biol�gicas, no son en esencia
diferentes a los utilizados para separar los l�pidos. Simplemente sucede que,
dado que las propiedades de las prote�nas son diferentes a las de los l�pidos,
los m�todos utilizados para separarlas y aislarlas de las membranas son diferentes.
En el caso de las prote�nas de la membrana que se encuentran en contacto con
los fosfol�pidos, uno de los procedimientos que m�s se utiliza, consiste en
la extracci�n de las mismas con detergentes. Por tener �stos una estructura
m�s o menos semejante a la de los fosfol�pidos, pueden sustituirlos y extraer
a las prote�nas de las membranas. En forma muy general, lo que se extrae de
las membranas cuando se usa un detergente es la mezcla de las prote�nas que
�stas contienen, pero en lugar de estar asociadas a los fosfol�pidos se extraen
rodeadas de una capa de detergente (Figura 57).
Figura 57. Esquema de la extracci�n de una prote�na de la membrana con un detergente.
Dada la existencia de esta diferencia fundamental entre las prote�nas de la membrana que est�n asociadas a mol�culas de l�pidos, y las prote�nas de las c�lulas que en general se encuentran en el seno de un medio acuoso, los procedimientos que suelen utilizarse para separar una de otras y eventualmente purificarlas son semejantes a los empleados en la separaci�n de otras prote�nas. Tambi�n en este caso se hace uso de columnas de cromatograf�a, de manera semejante como se mencion� para los l�pidos; pero es obvio que los materiales utilizados para separar prote�nas deben ser diferentes a los materiales utilizados para la separaci�n de los l�pidos. Tambi�n sucede que, como en el caso de los l�pidos, en la actualidad es factible, al menos en principio, purificar cualquier prote�na de la membrana si se le da un tiempo y un esfuerzo suficientes.
Los carbohidratos. Dado que el contenido de carbohidratos en las membranas celulares no es tan grande como el de l�pidos y prote�nas, y var�a no s�lo en la proporci�n sino en el tipo de az�cares que contienen las membranas, no hay procedimientos universales para separarlos, principalmente por el hecho de que con frecuencia los carbohidratos se encuentran asociados a las prote�nas. En el caso de los az�cares, por lo tanto, los procedimientos son todav�a m�s diversos, pero tambi�n es posible separarlos, aislarlos y estudiarlos por m�todos anal�ticos.
ESTUDIO DE LAS FUNCIONES DE LAS MEMBRANAS
Como en el caso de los componentes y algunas otras propiedades, es posible estudiar las funciones celulares utilizando distintos tipos de preparaciones. Se pueden emplear c�lulas enteras u organelos intracelulares, pero cuando se estudian las funciones, una de las preparaciones que tiene mayor utilidad son las ves�culas obtenidas a partir de distintos tipos de membranas. Un ejemplo es el procedimiento para preparar ves�culas a partir de mitocondrias mediante el ultrasonido, en el que ocurre la ruptura de las mitocondrias principalmente debido a la estructura que �stas tienen, dando lugar a las llamadas part�culas submitocondriales, que adem�s de estar constituidas esencialmente por los mismos componentes de las membranas de la mitocondria entera, est�n dispuestas en forma invertida en su mayor�a, es decir, lo que era el interior de la mitocondria es ahora el exterior de la part�cula y viceversa.
Hay muchos procedimientos de ruptura de las membranas para preparar ves�culas. Como en el caso anterior, algunos producen ves�culas en las que se invierte la polaridad original u orientaci�n de los lados de la membrana, pero en otros �sta se conserva. Es as� como se puede "jugar", por as� decirlo, con los procedimientos, para preparar diferentes tipos de membranas a partir de los distintos sistemas biol�gicos que se estudian.
LOS LIPOSOMAS Y LOS PROTEOLIPOSOMAS
Tal vez una de las preparaciones que mayor informaci�n ha proporcionado en los �ltimos a�os dentro del estudio de las funciones de las membranas es la de los liposomas o proteoliposomas. Son ves�culas que se forman utilizando diferentes fosfol�pidos mediante distintos procedimientos, pero el m�s com�n es el siguiente: tomando una cierta cantidad de fosfol�pidos, se les coloca en una soluci�n adecuada a los estudios que se desean realizar y se les somete a un tratamiento variable seg�n la preparaci�n requerida, utilizando ultrasonido, es decir una vibraci�n de muy alta frecuencia que tiene como objetivo fundamental dispersar a las mol�culas en el l�quido, y producir finalmente ves�culas como las que se describieron en el cap�tulo II, formadas por una doble capa de fosfol�pidos, con una cavidad l�quida en su interior. Como tambi�n se mencion� en el cap�tulo II, estas ves�culas tienen la estructura b�sica de las membranas celulares y comparten con ellas las propiedades fundamentales, principalmente en cuanto a permeabilidad.
Pero la utilidad m�s grande de los liposomas deriva de la posibilidad que hay
de purificar las prote�nas de las membranas y de incluirlas o reincorporar�as
a ellos, para formar los llamados proteoliposomas. De esta forma es como se
completa con frecuencia el proceso mediante el cual se demuestra que alg�n componente
de la membrana tiene cierta funci�n. En principio, la manera ideal de lograr
esto consiste en aislar a la prote�na que se supone responsable de un fen�meno,
incorporarla aislada a un liposoma, y demostrar que en efecto, cuando se le
ha aislado e incorporado en estas condiciones, es capaz de realizar la funci�n
que hipot�ticamente se le hab�a atribuido (Figura 58).
Figura 58. La incorporaci�n de prote�nas aisladas en ves�culas de fosfol�pidos puros.
Por ejemplo, la Figura 59 muestra algunos casos, desde el m�s simple y ya descrito
anteriormente de la valinomicina, de la cual se dice que es capaz de mover con
gran selectividad iones de potasio a trav�s de las membranas biol�gicas. Si
se incorpora este antibi�tico a liposomas que se han preparado en un medio rico
en potasio, y est�n llenos de �ste, y se coloca luego a las ves�culas en un
medio libre de potasio, es posible demostrar que, en efecto, el potasio sale
de las ves�culas cuando se agrega el antibi�tico.
Figura 59. Esquema de dos sistemas de transporte que se hacen funcionar en liposomas formados con fosfol�pidos puros.
Otro ejemplo que tambi�n se muestra en la figura es el de la ATpasa mitocondrial,
que se supone es capaz de romper mol�culas de ATP y simultaneamente
bombear protones o hidrogeniones de un lado al otro de la membrana, o bien,
cuando se genera una diferencia suficientemente grande de la concentraci�n de
hidrogeniones en ambos lados de la membrana, la enzima puede sintetizar ATP
a partir de sus componentes, el ADP y el fosfato. El experimento fue realizado
hace ya muchos a�os por Ephraim Racker, aislando la enzima e incorpor�ndola
en las ves�culas de fosfol�pidos obtenidos de la soya.
Otro de los m�todos que se han utilizado para hacer experimentos m�s o menos
semejantes a los planteados con los liposomas, consiste en la formaci�n de membranas
abiertas, pero que se pueden estudiar seg�n el sistema presentado en la Figura
60, y que estriba esencialmente en preparar una soluci�n de fosfol�pidos en
un solvente adecuado y colocar una gota de �ste con un pincel sobre el orificio
de una pieza de pl�stico, que suele ser de tefl�n. El resultado del procedimiento
es el que se describe en la misma figura, y consiste en la formaci�n de una
doble capa de fosfol�pidos en el peque�o orificio de la pieza de pl�stico, que
parece conservar todas las propiedades de tina doble capa de fosfol�pidos.
Con este sistema tambi�n es posible estudiar las propiedades de la doble capa de los fosfol�pidos, as� como de incorporar a ella distintos tipos de sustancias o prote�nas, y demostrar ciertas funciones que puedan interesar al investigador.
Hay diferentes ventajas en las membranas planas con relaci�n a los liposomas. En �stos, el volumen exterior es extremadamente peque�o en relaci�n con el exterior, y no se pueden hacer estudios directos de sus cambios y algunas otras propiedades. En el caso de las membranas planas, si el orificio se coloca en medio de dos c�maras, la bicapa que se forma puede estudiarse utilizando electrodos o el transporte de sustancias cargadas; �sto se logra detectando con los electrodos el paso de iones a trav�s de la bicapa, que se manifiesta de la misma forma como si se tuviera el paso de corriente a trav�s de la doble capa de fosfol�pidos.
ESTUDIOS SOBRE EL TRANSPORTE A TRAV�S DE LAS MEMBRANAS
Una de las funciones m�s importantes y probablemente m�s estudiadas en las membranas biol�gicas es la del transporte de distintos tipos de sustancias. Se han dise�ado distintos m�todos experimentales para estudiarlo; sin embargo, todos tienen en principio la misma base de operaci�n. Lo m�s importante para seguir el paso de una sustancia a trav�s de una membrana, o su incorporaci�n a una ves�cula, es contar con un m�todo para detectarla. Para algunos estudios de transporte se cuenta con muy diversos procedimientos anal�ticos, con el objeto de medir, ya sea su incorporaci�n a una ves�cula o a un organelo, o su paso a trav�s de una bicapa plana.
No obstante que los procedimientos anal�ticos son extremadamente diversos, en much�simos casos uno de los sistemas m�s utilizados es el empleo de is�topos radiactivos que se pueden seguir con relativa facilidad, estudiando simplemente la radiactividad incorporada o transportada de un lado a otro de una membrana o al interior de una ves�cula u organelo, etc�tera.
Para estudiar el transporte de sustancias en las membranas, dado que en general se tienen ves�culas u organelos cerrados, el procedimiento consiste en colocar a �stos en presencia del material que supuestamente se va a transportar, dejar transcurrir un cierto tiempo que puede ser desde unos cuantos segundos hasta horas, y luego separar las ves�culas del medio en que se les ha colocado por distintos procedimientos. La Figura 61 muestra en forma esquem�tica los procedimientos m�s frecuentes en este tipo de estudios que consisten en la separaci�n de las ves�culas por filtraci�n, por centrifugaci�n, o por el empleo de columnas. En todos los casos el principio es esencialmente el mismo, y se trata de obtener aisladas las ves�culas y el medio en que se hab�an colocado, para detectar diferencias entre el estado inicial y el logrado despu�s de un cierto periodo de incubaci�n.
Tambi�n para el estudio de los receptores, dado que lo que se trata en muchos de los casos de la interacci�n de una sustancia con estas mol�culas, los procedimientos empleados son semejantes a los utilizados en el transporte. En este caso es necesario tambi�n contar con m�todos para detectar, con frecuencia, concentraciones sumamente bajas de las sustancias que se fijan a los receptores. Igualmente para el estudio de los receptores las sustancias que mayor utilizaci�n tienen son las marcadas con is�topos radiactivos.
Los procedimientos son semejantes a los empleados para estudiar el transporte. La diferencia entre un transportador y un receptor es simplemente que en el caso del transportador la sustancia utilizada se transfiere de un lado a otro de la membrana, y en el caso de un receptor �sta suele fijarse s�lo de un lado de la membrana, pero de todas formas la fijaci�n se hace con tal intensidad que al separar la preparaci�n membranal del medio en que se ha incubado es posible detectar cantidades variables de las sustancias unidas a los receptores.
Del mismo modo que para los estudios del transporte, los procedimientos de separaci�n de las membranas del medio en que se han colocado durante la etapa experimental suelen ser la filtraci�n y la centrifugaci�n.
Hemos revisado algunos de los procedimientos m�s comunes que se utilizan en el estudio de las membranas biol�gicas. Sin embargo, debe quedar claro que hay una gran cantidad de funciones de las membranas, y que los enfoques utilizados para su estudio pueden ser de lo m�s diverso. Por ejemplo, durante el funcionamiento de algunos sistemas de transporte es frecuente que se generen diferencias de potencial el�ctrico, es decir, diferencias de concentraci�n de cargas en ambos lados de una membrana.
Estas diferencias de potencial se pueden estudiar utilizando, por ejemplo, membranas planas y electrodos colocados a ambos lados de ellas. Pero tambi�n pueden estudiarse las diferencias de potencial empleando c�lulas, liposomas o proteoliposomas, vali�ndose de la propiedad que algunas sustancias tienen para cambiar sus caracter�sticas f�sicas, cuando se mueven de un lado a otro de la membrana, llevadas por una diferencia de potencial.
Por ejemplo, es posible detectar cambios de potencial el�ctrico en una membrana
utilizando el colorante llamado oxonol V. �sta es una mol�cula fluorescente
que puede moverse con cierta libertad a trav�s de las membranas biol�gicas,
y si hay un potencial positivo dentro de una ves�cula, la sustancia se acumula
dentro de ella. Al acumularse en el interior de la ves�cula, la fluorescencia
de algunas de las mol�culas es absorbida por las otras debido a su cercan�a
por la misma acumulaci�n de que han sido objeto, y si se mide �sta en un aparato
adecuado, un fluor�metro, es posible detectar en el tiempo los cambios de potencial
por los cambios de fluorescencia de esta sustancia (Figura 62).
Figura 62. Medida de la diferencia de potencial el�ctrico por la acumulaci�n de una sustancia fluorescente.
As� como hay indicadores capaces de seguir diferencias de potencial entre los lados de una membrana, se pueden tambi�n estudiar cambios en la concentraci�n de hidrogeniones con sustancias adecuadas, en general colorantes o indicadores fluorescentes. Tambi�n es posible utilizar algunos indicadores que son mol�culas capaces de sufrir cambios de color o de fluorescencia cuando se fijan a determinadas sustancias, como el calcio, el magnesio, u otros iones.
Hay, en resumen, un n�mero enorme de t�cnicas que se pueden utilizar en el estudio de las membranas solamente en el �rea del transporte biol�gico. Baste decir �nicamente que igual que para otros estudios y actividades, un investigador cient�fico no tiene m�s l�mites que su imaginaci�n para dise�ar los m�todos que le permitan plantear los experimentos adecuados, para conocer la verdad y los detalles de alg�n proceso biol�gico.
Por otra parte, con frecuencia no solamente se busca conocer las propiedades funcionales de un componente de una membrana. En esta �poca son numerosos los casos en los cuales se busca conocer la regulaci�n gen�tica de la cantidad o las propiedades de un determinado transportador. Hay muchos estudios de sistemas de transporte en los cuales se utilizan t�cnicas gen�ticas, ya sea en cultivos de c�lulas o en microorganismos o inclusive las opciones que brinda la biolog�a molecular y la ingenier�a gen�tica para producir cambios deseables en un sistema membranal.
Los estudios en el �rea de las membranas biol�gicas utilizan herramientas desarrolladas por muchas otras ciencias que incluyen a la gen�tica, la f�sica, la qu�mica, la biolog�a molecular, la ingenier�a gen�tica, etc. Son tantas las facetas que requiere el estudio de �stos o cualesquiera otros sistemas o fen�menos biol�gicos, que pr�cticamente no hay ni debe haber limitaci�n alguna en cuanto a las ciencias o herramientas que los investigadores utilicen para profundizar cada vez m�s sobre el conocimiento de esos fen�menos.
