III. EL PROCESO DE INFECCI�N VIRAL
LA INFECCI�N se inicia cuando entran en contacto una part�cula
viral y una c�lula susceptible. En el caso de fagos y bacterias en un cultivo
en suspensi�n, la interacci�n entre ambos ocurre por simple difusi�n, ya que
part�culas con el tama�o de bacterias y virus se encuentran en permanente movimiento
browniano cuando est�n en suspensi�n. En el caso de los virus animales, la difusi�n
es tambi�n el factor m�s importante que afecta la uni�n con c�lulas animales
en cultivo, ya que esta asociaci�n es independiente de la temperatura mientras
�sta no afecte el movimiento browniano. Probablemente en el caso de la infecci�n
en el animal entero existen otros factores que afectan la asociaci�n entre el
virus y las c�lulas; sin embargo, es muy dif�cil dise�ar experimentos para estudiar
la interacci�n entre virus y c�lulas animales in vivo. En el caso de
las plantas, la infecci�n viral generalmente es consecuencia de da�o mec�nico
previo, hecho a la planta por factores externos. En otras ocasiones, la infecci�n
viral en plantas es el resultado de la acci�n de insectos portadores del virus
que act�an como vectores del mismo, introduci�ndolos en plantas susceptibles.
La mayor�a de los fagos se adsorben (pegan) a la pared celular de las bacterias susceptibles, pero algunos fagos tambi�n son capaces de adsorberse a los flagelos, vellosidades (pili) o c�psulas presentes en la superficie de la bacteria hospedera. El caso mejor documentado de adsorci�n viral est� representado por los fagos T2 y T4, los cuales son virus con morfolog�a compleja que incluye una cabeza, cola, placa basal, clavijas y fibras de la cola. La pegada inicial de estos fagos a los receptores presentes en la superficie de la bacteria ocurre por medio de los extremos distales de las fibras de la cola. Estas fibras largas que hacen la primera uni�n se doblan por en medio, de manera que sus extremos distales hacen contacto con la pared celular a muy corta distancia del punto medio de la part�cula viral. Despu�s de ocurrida la adhesi�n, la part�cula viral se aproxima a la superficie de la c�lula. Cuando la placa basal del fago se encuentra a unos 100Å (angstrom= 10-10m) de la pared celular, se establece contacto entre las peque�as clavijas de la placa basal y la pared celular, pero no existe evidencia de que la propia placa basal se adhiera a la pared celular (figura III.1.).
Figura III.1. Esquema de los principales eventos en la adsorci�n del bacteri�fago
T4 a la pared celular de la bacteria E. coli.(a) el fago libre muestra
las fibras y clavijas de la cola. (b)Adhesi�n de las fibras de la cola. (c)
El fago se acerca a la pared celular y las clavijas entran en contacto con la
pared celular.
Algunos fagos con cola, como el fago PBSl, se adsorben a los flagelos bacterianos
en lugar de a la pared celular. La punta de la cola de este fago tiene una fibra
flexible que se adhiere alrededor del filamento del flagelo y entonces el fago
se desliza por el filamento hasta alcanzar la base del flagelo. Otros fagos
con cola se adsorben a la c�psula de la bacteria. Finalmente, algunos fagos
se adhieren a los llamados pili o vellosidades sexuales de las bacterias
que contienen el factor sexual "F" o ciertas colicinas (factores de resistencia
contra agentes antimicrobianos). Los fagos filamentosos que contienen ADNARN
En el caso de los virus animales, ha sido posible estudiar c�mo se adhieren
a las c�lulas en cultivo y de esta manera determinar el efecto que tienen la
temperatura y la concentraci�n de iones en el medio sobre la adsorci�n viral.
Al igual que en el caso de los fagos, la adhesi�n parece ser de tipo electrost�tico
y es afectada en forma importante por la presencia de iones en medio de cultivo.
Sin embargo, todav�a se sabe poco en relaci�n con la naturaleza de los receptores
celulares para los virus animales, con excepci�n de aquellos receptores involucrados
en la adsorci�n de los virus de la poliomielitis, la influenza y el SIDA
(s�ndrome de inmunodeficiencia adquirida). Cuando las c�lulas susceptibles al
virus de la polio son disociadas al someterlas a congelamiento y subsecuente
descongelamiento, liberan una substancia que constituye el receptor celular
para el virus. Aparentemente, este receptor es de naturaleza proteica y sus
mol�culas pueden ser saturadas en presencia de un exceso de part�culas virales.
Se ha estimado que existen aproximadamente 3 x 10 3
receptores para el poliovirus en la superficie de cada c�lula susceptible; esto
representa un �rea equivalente al 0.3% de la superficie total de la c�lula.
Las c�lulas que carecen de tal receptor espec�fico son inmunes a la infecci�n
por poliovirus. Sin embargo, tales c�lulas no susceptibles pueden permitir la
replicaci�n normal del virus cuando �ste es introducido en ellas por m�todos
artificiales.
Cuando se incuban virus de la influenza en presencia de eritrocitos (gl�bulos rojos), las c�lulas se aglutinan (hemaglutinaci�n) y este fen�meno puede ser utilizado para titular la concentraci�n del virus, simplemente determinando a qu� diluci�n el virus se vuelve incapaz de producir hemaglutinaci�n. C�lulas aglutinadas a 4°C pueden ser calentadas a 37°C, lo cual produce separaci�n de las c�lulas y el virus eluido de estas c�lulas puede ser utilizado para aglutinar un nuevo lote de c�lulas. Sin embargo, las c�lulas que previamente estuvieron en contacto con el virus son incapaces de ser reaglutinadas cuando entran en contacto con virus frescos. Esto se debe a la producci�n y activaci�n de una enzima conocida como enzima destructora del receptor (EDR). Si se aplica una soluci�n de esta enzima al tracto respiratorio de animales experimentales, es posible evitar la infecci�n por el virus de la influenza, ya que el virus no puede adsorberse a las c�lulas cuyo receptor espec�fico para el virus ha sido degradado por la acci�n de la enzima. El receptor para el virus de la influenza se caracteriza por tener una mol�cula de �cido neuram�nico en su extremo distal, el cual forma parte de un peque�o pol�mero de mol�culas de carbohidrato (oligosac�rido); este pol�mero est� unido en forma covalente a una prote�na insertada en la membrana celular.
El caso mejor estudiado de la penetraci�n de un virus en la c�lula hospedera
est� representado por el caso del fago T2. La cola de este fago es contr�ctil
y en su forma extendida consiste de 24 anillos de subunidades que forman una
funda que rodea a un elemento central. Cada anillo consta de 6 subunidades peque�as
y 6 subunidades mayores. Despu�s de la adsorci�n del fago a la pared celular,
ocurre una contracci�n de la cola que resulta en una fusi�n de las subunidades
peque�as y grandes para dar 12 anillos de 12 subunidades. El n�cleo de la cola
no es contr�ctil y por lo tanto es expulsado e impulsado a trav�s de las capas
externas de la bacteria; a continuaci�n, la cabeza del fago se contrae y esto
resulta en la inyecci�n del ADNATP)
en la funda de la cola del fago; la energ�a para la contracci�n de esta funda
proviene de la conversi�n de la ATP en adenosina difosfato (ADP)
por medio de una reacci�n hidrol�tica que libera un grupo fosfato de la ATP
(figura 111.2.).
FIGURA III.2. Esquema del mecanismo de penetraci�n del material gen�tico del
fago T4 o T2 a trav�s de la pared celular de la bacteria. (a) Las clavijas del
fago entran en contacto con la pared celular y la funda se encuentra extendida.
(b) La funda de la cola se contrae y el material gen�tico del fago penetra la
pared celular; la lisozima presente en el fago digiere la porci�n de pared celular
localizada directamente bajo la part�cula viral.
Muchos bacteri�fagos carecen de fundas contr�ctiles y todav�a se desconoce el mecanismo detallado por medio del cual penetran en las bacterias. Sin embargo, existe evidencia de que algunos de estos fagos introducen en la c�lula material proteico adem�s del �cido nucleico.
Las c�lulas animales carecen de pared celular y s�lo est�n rodeadas por la membrana plasm�tica que es muy flexible y cambiante en sus componentes estructurales. Las c�lulas animales continuamente introducen elementos del medio externo por medio del proceso de pinocitosis y a trav�s de un procedimiento similar, pero inverso, exportan al medio diversas substancias como enzimas, hormonas y neurotransmisores. Los virus animales solamente pueden infectar c�lulas que poseen receptores espec�ficos para el virus en particular. Por lo tanto, se requieren diferentes receptores para diferentes tipos de virus. Se conoce con poco detalle el mecanismo preciso por medio del cual los virus penetran en las c�lulas animales. Buena parte del problema radica en que la mayor�a de las part�culas virales que infectan a una c�lula son incapaces de iniciar con �xito la multiplicaci�n del virus.
Usualmente, estas part�culas no infecciosas superan a las part�culas infecciosas
en proporci�n de 1000:1, y no existen m�todos bioqu�micos o microsc�picos que
puedan distinguir entre ambos tipos de part�culas virales antes de que haya
ocurrido la infecci�n propiamente dicha. Todos los virus ARN y
ADN producen estas part�culas defectuosas conocidas como interferentes-defectuosas
(ID), las cuales son el resultado de errores en la s�ntesis de �cido nucleico
viral. Estas part�culas ID son mutantes que carecen de segmentos de �cido nucleico
y por lo tanto son incapaces de reproducirse sin la ayuda de part�culas virales
normales capaces de suplir la informaci�n gen�tica ausente en el genoma de las
part�culas ID. Por esta raz�n, la propagaci�n de las part�culas ID es �ptima
cuando las c�lulas son infectadas en altas multiplicidades de infecci�n. Las
part�culas ID deprimen el rendimiento de la progenie viral infecciosa debido
a que compiten por ciertos productos sintetizados en cantidades limitadas por
las part�culas virales infecciosas.
Los virus con envoltura pueden penetrar a la c�lula hospedera por medio de
la fusi�n entre las envolturas virales y la membrana de la c�lula. Tanto los
virus con envoltura como los virus que carecen de �sta pueden ser introducidos
a la c�lula por medio del proceso de pinocitosis (figura III.3.). La
fusi�n de membranas ocasiona la liberaci�n del genoma viral en el citoplasma
de la c�lula, pero en el caso de la pinocitosis el virus entero es contenido
en una ves�cula formada a partir de la membrana plasm�tica. Es probable que
esta ves�cula se fusione a su vez con alguna de las membranas internas de la
c�lula y la cubierta viral es modificada a consecuencia de esta fusi�n, lo que
da lugar a la liberaci�n del �cido nucleico viral. Es importante hacer notar
que la penetraci�n del virus y la subsecuente eliminaci�n de las envolturas
virales no implican forzosamente la presencia intracelular de �cido nucleico
viral desnudo. El �cido nucleico viral puede permanecer unido a las prote�nas
internas del virus, las cuales pueden incluir enzimas necesarias para la replicaci�n
del virus. En el caso de cierto tipo de virus ARNARNARN
FIGURA III.3. Esquema de la penetraci�n y desnudamiento
de los virus en c�lulas animales. (a) Penetraci�n y desnudamiento por medio
de la fusi�n de las membranas viral y plasm�tica. (b) Penetraci�n y desnudamiento
por pinocitosis seguida por fusi�n con la membrana citoplasm�tica interna.
La gran mayor�a de los virus animales son muy ineficientes en lograr la penetraci�n
de las c�lulas susceptibles. Por ejemplo, en infecciones por poliovirus, la
mayor parte del ARN
En teor�a, resulta posible evitar las infecciones virales interfiriendo con los mecanismos de adsorci�n y penetraci�n del virus. Sin embargo, la mayor�a de los receptores est�n constituidos por prote�nas y glicoprote�nas que tienen funciones importantes en el funcionamiento normal de la membrana celular y s�lo en forma incidental resultan ser de importancia tal para las necesidades del virus. Por lo tanto, estas prote�nas no pueden ser eliminadas o modificadas sin afectar a la c�lula misma. Todav�a se sabe muy poco en relaci�n con la qu�mica de las prote�nas que forman parte de las cubiertas virales y hasta la fecha solamente se conoce una sustancia bien caracterizada capaz de inhibir la adsorci�n y penetraci�n de un virus sin que, por otra parte, induzca efectos secundarios indeseables. Esta sustancia es la amantadina, que puede evitar ciertos eventos en la penetraci�n del virus de la influenza, pero todav�a no se conoce con exactitud su mecanismo de acci�n.
c) CLASIFICACI�N FUNCIONAL DE LOS VIRUS
Los virus muestran una gran diversidad en su morfolog�a: la estructura de sus
�cidos nucleicos, el modo de infecci�n, regulaci�n y desarrollo. Por lo tanto,
resulta dif�cil establecer un concepto clasificador que simplifique el an�lisis
del proceso de replicaci�n (reproducci�n) viral. Sin embargo, David Baltimore
ha propuesto un sistema de clasificaci�n de los virus basado en el modo como
�stos expresan sus genes y llevan a cabo la replicaci�n de su material gen�tico.
En esta clasificaci�n los virus est�n divididos en grupos de acuerdo con el
modo como llevan a cabo la s�ntesis del ARNARNARNm es designado como positivo (+) ARN y las
cadenas de ADN o de ARN o de ambos que son complementarias
en secuencia de nucle�tidos a la del ARNm, son denominadas como
negativas (-). Aquellas cadenas de nucle�tidos cuya secuencia no es complementaria
a la del ARNm son denominadas tambi�n como positivas (+). Con base
en esta terminolog�a, es posible distinguir seis clases de virus:
Clase 1: est� constituida por todos los virus que tienen un genoma formado
por ADN de cadena doble. En esta clase no se aplica la designaci�n
+/-, pues diferentes especies de ARN>m se originan a partir de diferentes
segmentos de ambas cadenas del ADN viral.
Clase II: consta de virus cuyo genoma est� constituido por ADNARNm.
En esta clase de virus, el ADN del genoma debe ser temporalmente
convertido a la forma de cadena doble antes de que ocurra la transcripci�n del
ADN en ARNm.
Clase III: est� compuesta por virus cuyo genoma es ARN
de cadena doble. Todos los virus conocidos que forman parte de este grupo tienen
genomas segmentados, pero el ARNARN
Clase IV: est� representada por los virus con ARN de cadena
sencilla cuya secuencia es la misma del ARNm. En estos virus la
s�ntesis de una cadena complementaria al ARNARN
Clase V: est� formada por los virus que poseen un genoma de ARNARN
Clase VI: consta de virus que poseen un genoma de ARN de
cadena sencilla y que producen un ADN intermediario durante el
proceso de replicaci�n. En algunos miembros de esta clase el ARN
del genoma y el ARNm tienen la misma secuencia.
d) LA REPLICACI�N DEL ADN VIRIL
El mecanismo por medio del cual una mol�cula de ADN es duplicada
(replicada) in vivo es el mismo, independientemente del origen viral
o celular del ADN. A primera vista, la replicaci�n del ADN
parece un proceso sencillo: una enzima polimerasa se mueve a lo largo de la
mol�cula de ADN produce dos cadenas hijas a partir del templado
constituido por las cadenas de la mol�cula madre. Este modelo de replicaci�n
implica que en cada una de las mol�culas hijas existe una cadena derivada de
la mol�cula original y otra cadena formada por ADN reci�n sintetizado,
o sea, la replicaci�n del ADN es de tipo semiconservativo. Este
hecho fue demostrado por Meselson y Stahl a trav�s de un famoso y ahora ya cl�sico
experimento.
Debido a su tama�o relativamente peque�o y a la facilidad con que pueden ser
manipuladas in vitro, las mol�culas del ADN viral han sido
frecuentemente utilizadas para estudiar el mecanismo de la s�ntesis de ADN
en general. Toda cadena, lineal de ADNADN son antiparalelas, o sea, tienen secuencias complementarias
pero que corren e direcciones opuestas. Por lo tanto, una consecuencia del modelo
semiconservativo para la replicaci�n del ADN consiste en que una
de las cadenas hijas es sintetizada en direcci�n 3' �
5', mientras que la otra cadenas, hija es sintetizada en direcci�n 5'�
3'. Sin embargo, todas las ADN polimerasas, tanto virales como
celulares, purificadas hasta la fecha, sintetizan ADN solamente
en la direcci�n 5'� 3'. Una soluci�n a este
problema consiste en que la s�ntesis de una de las cadenas hijas se realiza
en forma continua en direcci�n 5'� 3' a lo
largo de la cadena madre que sirve como templado, la llamada cadena l�der.
Mientras que la s�ntesis de la otra cadena hija ocurre en forma discontinua
pero tambi�n en direcci�n 5'� 3' a lo largo
de la otra cadena madre denominada la cadena rezagada. Los fragmentos de ADN
producidos por la s�ntesis discontinua (fragmentos de Okazaki) pueden ser unidos
por la acci�n de una enzima conocida como ADN ligasa. Sin embargo,
otro problema en la replicaci�n del ADN consiste en que las ADN
polimerasas necesitan la presencia de un fragmento de �cido nucleico que sirva
como punto de iniciaci�n para la s�ntesis de ADN, o sea, no pueden
iniciar la s�ntesis de novo. Por su parte, la ARN polimerasa
que sintetiza el ARN no requiere de la presencia de un fragmento
iniciador para llevar a cabo la s�ntesis del polinucle�tido. Por lo tanto, la
ARNARN
complementarios a la cadena madre de ADN; dichos fragmentos servir�n
como puntos de iniciaci�n para la s�ntesis del ADN que formar�
parte de la nueva cadena hija. Posteriormente, son degradados los fragmentos
de ARNADN
resultantes son unidos por acci�n de la enzima ADN ligasa.
Figura III.4. Esquema de la s�ntesis discontinua del ADN
Figura III.5 Participaci�n de un primer de ARN
El proceso de replicaci�n del ADNADN. Se ha calculado que el �ndice de error en la fidelidad
de copiado equivale a la introducci�n de un nucle�tido err�neo por cada 109
-10 10 nucle�tidos copiados en forma complementaria.
Esta alta fidelidad de copiado se debe a que las ADN polimerasas
(cuando menos en bacterias) tienen la capacidad de "editar" el ADN
reci�n sintetizado y corregir los errores en la copia de la secuencia de nucle�tidos
por medio de una actividad enzim�tica asociada con la polimerasa; esta actividad
conocida como exonucleasa 3'
5' permite romper la uni�n establecida entre el OH- presente
en el extremo 3' de la cadena de ADNADN (figuras
III.4 y III.S.).
Los bacteri�fagos T contienen mol�culas lineales de ADN de cadena
doble, las cuales son replicadas ya sea por la acci�n de polimerasas espec�ficas
a estos fagos o por las polimerasas de la c�lula hospedera que han sido modificadas
en su especificidad a consecuencia de la infecci�n viral. Los productos inmediatos
de la replicaci�n del ADNADN original. Estas grandes mol�culas pueden
ser formadas por la uni�n de los extremos de mol�culas lineales de ADN
o por medio de un proceso c�clico llamado c�rculo rodante que permite
la replicaci�n continua de un templado circular para producir estructuras compuestas
de m�ltiples unidades moleculares (figuras III.6 y III.7.). La formaci�n de
grandes mol�culas concatenadas explica por qu� las propiedades estructurales
y gen�ticas de los fagos T sugieren que su mapa gen�tico es circular. En estos
fagos el precursor inmediato del ADN viral es una gran mol�cula;
esta mol�cula es fragmentada por la acci�n de enzimas nucleasas que dividen
la macromol�cula en subunidades cuya longitud corresponde a la del ADN
original. Esta fragmentaci�n ocurre antes o durante el proceso de encapsidaci�n.
Durante la replicaci�n del fago T4 se generan mol�culas que poseen secuencias
redundantes en sus extremos terminales (ej.: ABC... YZABC). De hecho, en una
poblaci�n de fagos T4 no todas las mol�culas de ADN viral empiezan
con la misma secuencia, y a pesar de que estas mol�culas son lineales, el an�lisis
gen�tico muestra que su mapa gen�tico es circular. Esto es consecuencia de la
fragmentaci�n de m�ltiples cadenas concatenadas, las cuales son reducidas al
tama�o correcto para poder ser empacadas en las cabezas de los fagos. El mecanismo
de c�rculo rodante ha sido particularmente estudiado en el caso de algunos fagos,
como el fago l el fago ØXI74.
Figura III.6. Posible mecanismo para la producci�n de cadenas de ADN
Figura III.7. El mecanismo del c�rculo rodante.(a) ADNADN polimerasa a�ade nucle�tidos en el extremo 3 de la cadena
abierta, de manera que produce desplazamiento del extremo 5 . (d) El desplazamiento
del extremo 5 se hace m�s extenso en la medida que la enzima polimerasa recorre
el templado de ADN circular (cadena negativa). El resultado es
la formaci�n de un ADN con longitud mayor a la normal.
En general, la replicaci�n de los virus ADNADN celular y una caracter�stica
com�n es la presencia de estructuras circulares temporales cuando menos en algunas
de las etapas del proceso de replicaci�n. La abundancia del ADN
circular en diferentes tipos de virus sugiere que el c�rculo representa el formato
m�s importante en la replicaci�n del ADN viral, y la forma lineal
de la mol�cula es una adaptaci�n (particularmente en el caso de los fagos T)
que permite efectuar la inyecci�n del �cido nucleico viral a trav�s de la cola
del virus. Solamente los fagos con cola tienen genomas lineales, los otros tipos
de fago poseen genomas circulares.
En los �ltimos quince a�os se han logrado importantes avances en el conocimiento
de los mecanismos de replicaci�n del ADN en varios tipos de virus
animales. La gran variedad en el tama�o y organizaci�n de los genomas virales
implica una gran diversidad en los detalles asociados con la replicaci�n del
ADN
Sin embargo, es importante hacer notar que todav�a existen m�ltiples inc�gnitas
respecto a la replicaci�n del ADN tanto en los virus como en las
c�lulas en general. La autonom�a de los virus en cuanto a su capacidad para
replicar el ADNARNADN
Se conocen varios casos en los cuales un tipo de virus animal no puede replicarse en el interior de alg�n tipo de c�lulas en particular a pesar de haber sido capaz de iniciar la infecci�n en las mismas. Por ejemplo, los adenovirus humanos pueden infectar cultivos de c�lulas renales de mono, pero no pueden crecer en estas c�lulas. Sin embargo, la coinfecci�n de dichas c�lulas con virus SV40 permite la replicaci�n del adenovirus por medio de la formaci�n de una progenie de h�bridos SV4Oadenovirus, los cuales contienen diferentes cantidades de sus respectivos genomas unidos en forma covalente. Esto implica que el virus SV4O act�a como auxiliar para la replicaci�n del adenovirus, proporcionando factores que est�n ausentes en ese tipo de c�lula hospedera en particular, factores que son necesarios para la replicaci�n del adenovirus.
Frecuentemente se observa que la coinfecci�n de una misma c�lula con dos diferentes mutantes o variedades de un mismo tipo de virus, cada uno de los cuales es defectuoso en alguna funci�n esencial para la replicaci�n del genoma viral, resulta en la producci�n de progenie viral con capacidad infectiva normal debida a la formaci�n de h�bridos entre los dos tipos de mutante, los cuales se complementan cancelando as� sus respectivas deficiencias gen�ticas y funcionales, de manera que estos h�bridos pueden desencadenar una infecci�n productiva. Este fen�meno de complementaci�n ha sido usado ampliamente para mapear y caracterizar los genes que codifican prote�nas virales ya sean �stas de tipo funcional o estructural.
e) S�NTESIS DEL ARN
GEN�MICO VIRAL
EN LOS VIRUS ARN
La s�ntesis del ARN por parte de los virus ARN involucra
la replicaci�n, que puede ser definida como la producci�n de una progenie de
genomas virales (ARN en este caso), y la transcripci�n que consiste
en la producci�n de ARN cuya secuencia de nucle�tidos es complementaria
a la del genoma. Debido a que los genomas de los virus ARN pueden
ser de sentido positivo (+) o sentido negativo (-) [v�ase la clasificaci�n de
Baltimore], la transcripci�n en estos virus, a diferencia de lo que ocurre en
el caso de los virus ADN, no es siempre sin�nimo de la s�ntesis
de ARN mensajero.
La mayor�a de los virus ARN poseen mol�culas de cadena sencilla
y por lo tanto la replicaci�n consiste en que una secuencia de ribonucle�tidos
deerminada debe ser copiada para producir exactamente la misma secuencia, por
ejemplo: ACGU ACGU. La
informaci�n actualmente disponible indica que el apareamiento entre las bases
A-U y C-G es la clave para la replicaci�n del ARN viral; por lo
tanto, en estos virus se aplican tambi�n los principios fundamentales relacionados
con la replicaci�n del ADN
A principios de los a�os sesenta fueron descubiertos los primeros fagos ARN
y casi al mismo tiempo se demostr� que los picornavirus, que se caracterizan
por tener ARN de cadena sencilla, son capaces de replicarse en
c�lulas animales en las cuales la s�ntesis del ADN y su subsecuente
transcripci�n en mol�culas de ARN mensajero celular hab�a sido
inhibida por la droga actinomicina D, la cual se intercala en la mol�cula
de ADNADN, de manera que las enzimas como la ADNARN polimerasa no pueden cumplir con la funci�n de llevar
a cabo la replicaci�n o la transcripci�n de este ADN. En presencia
de actinomicina D se detiene la s�ntesis de ARN celular; por lo
tanto, se pueden infectar las c�lulas con virus ARN en presencia
de precursores radiactivos del ARN (como 3H-uridina)
y colectar muestras de estas c�lulas a intervalos apropiados despu�s de la infecci�n;
estas muestras pueden ser fraccionadas por medio de detergentes y solventes
org�nicos de manera que se pueden aislar y analizar las nuevas mol�culas de
ARN, cuya s�ntesis ha sido inducida por la infecci�n viral.
La mayor�a de los virus ARN (con excepci�n de los retrovirus)
se pueden replicar en presencia de inhibidores de la s�ntesis de ADN;
este hecho descarta la participaci�n de ADN intermediario en la
replicaci�n de estos virus. En 1963, Montagnier y Sanders demostraron la presencia
de ARN de cadena doble en c�lulas infectadas por el virus de la
encefalomiocarditis (EMCV), el cual posee solamente ARN de cadena
sencilla. As�, pronto fue establecido que el ARN de cadena doble
es una forma intermediaria en la replicaci�n de los virus ARN (con
excepci�n de los retrovirus). Este ARN de cadena doble se denomina
forma replicativa (FR) y se caracteriza por ser insensible a la acci�n de la
enzima ribonucleasa (ARNasa), la cual s�lo digiere el ARN
de cadena sencilla. Posteriormente, ha sido posible aislar otro tipo de ARN
intermediario constituido por mol�culas de cadena doble cuyos extremos est�n
desapareados originando "colas" de ARNARN constituye el intermediario de replicaci�n (IR). Sin embargo,
el FR y el IR parecen tener papeles diferentes en la replicaci�n de diferentes
tipos de virus ARN.
El fago Qb representa el modelo mejor estudiado
de la s�ntesis del ARNARN polimerasa dependiente de ARNARN del fago Q/b.
La s�ntesis de la cadena (-) de ARN complementaria al genoma viral
es detectada por la aparici�n de un nuevo ARN no infeccioso que
es resistente a ser digerido por la enzima ARNARN, que representa a la forma replicativa
(FR), coincide con la p�rdida de infectividad de las mol�culas de ARN
viral que sirvieron como templado. La s�ntesis de esta cadena (-) de ARN
es llevada a cabo por la replicasa del fago, la cual est� constituida por varias
subunidades de prote�na, algunas de las cuales son prote�nas codificadas por
la c�lula hospedera (como los factores de elongaci�n EF; Tu y Ts, normalmente
involucrados en el proceso de s�ntesis de prote�nas) las cuales son incorporadas
para formar la llamada holoenzima de la Qb
replicasa. Posteriormente, la s�ntesis de la nueva cadena (+) de ARNARNARNARNARN
El ARNARN se encuentran
libres de muchas restricciones asociadas con el ciclo de vida del virus. Esta
situaci�n es similar a un estado de evoluci�n precelular, cuando los factores
ambientales de la selecci�n natural actuaban directamente sobre el material
gen�tico en lugar de hacerlo sobre el producto (prote�na) codificado por el
gene. Sol Spiegelman y colaboradores dise�aron un experimento para determinar
qu� es lo que ocurre con las mol�culas de ARN cuando la �nica necesidad
consiste en que estas mol�culas se repliquen tan r�pidamente como les sea posible.
El producto de la reacci�n entre la Qb replicasa
y el ARN viral purificado puede actuar como templado para la s�ntesis
de m�s ARN. Por otra parte, cuanto m�s larga es una mol�cula de
ARN m�s tiempo tardar� en replicarse. Considerando estos factores,
resulta l�gico pensar que las nuevas mol�culas de ARN podr�n replicarse
m�s r�pidamente si eliminan informaci�n gen�tica que no tiene una importancia
esencial para el proceso de replicaci�n, de esta manera las mol�culas de ARN
pueden disminuir su tama�o y el tiempo necesario para la replicaci�n de las
propias mol�culas. Por ejemplo, si se a�ade la enzima Qb
replicasa a una mezcla de reacci�n constituida por mol�culas enteras y medias
mol�culas de ARN Qb purificado,
la replicaci�n de las medias mol�culas se realizar� en la mitad del tiempo necesario
para replicar las mol�culas enteras. Esto resulta en un exceso de medias mol�culas
que contin�an sirviendo como templado para la s�ntesis de nuevas medias mol�culas,
generando as� un exceso absoluto de mol�culas m�s peque�as. Spiegelman prepar�
una mezcla de reacci�n consistente en ARN Qb
purificado, trifosfatos de los ribonucle�tidos apropiados y la enzima Qb
replicasa. Despu�s de una corta incubaci�n, la mezcla de reacci�n fue diluida
121/2 veces en otro tubo de ensayo que conten�a la misma concentraci�n de la
enzima replicasa y los ribonucle�tidos precursores, pero en ausencia de ARNQb
. Esta secuencia de incubaciones y diluciones fue repetida 75 veces y la duraci�n
de las incubaciones fue siendo reducida paulatinamente aunque el factor de diluci�n
fue mantenido constante. Despu�s de la transferencia n�mero 75 fue posible aislar
una poblaci�n de mol�culas derivadas del ARN Qb
original, las cuales solamente conten�an 17% de la secuencia de nucle�tidos
presente en el ARNARN disminuye progresivamente cuando
es sometida a este proceso de selecci�n en funci�n de la velocidad de replicaci�n.
El �nico factor que tiene un efecto limitante en el acortamiento de las mol�culas
de ARNARNQb
.
La replicaci�n del fago Qb es s�lo un ejemplo de
las m�ltiples estrategias de replicaci�n exhibidas por los virus ARN.
Una vez m�s, el lector interesado deber� consultar la bibliograf�a para conocer
detalles sobre la replicaci�n de otros virus ARN.
Una pregunta importante es por qu� el �cido nucleico purificado a partir de
ciertos tipos de virus tiene capacidad infectiva, mientras que el �cido nucleico
purificado a partir de otros virus carece de esta capacidad. La respuesta consiste
en que los virus pertenecientes a las clases II, V y VI (de acuerdo con la clasificaci�n
de Baltimore), requieren que su informaci�n gen�tica sea transcrita en otro
tipo de �cido nucleico diferente al presente en el virus original. En la mayor�a
de los casos, esta transcripci�n es mediada por enzimas espec�ficas del virus,
las cuales est�n almacenadas en la part�cula viral. Ejemplo de estas enzimas
son la ARN polimerasa dependiente de ADN, caracter�stica
del virus de la vacuna; la ARN polimerasa dependiente de ARNADN
polimerasa dependiente de ARN caracter�stica de los retrovirus.
El �cido nucleico purificado a partir de estos virus carecer� de estas enzimas
necesarias para la transcripci�n y subsecuente replicaci�n de dicho �cido nucleico,
y las c�lulas infectadas no cuentan con enzimas capaces de utilizar estos tipos
de �cido nucleico viral como templado.
f) LA REGULACI�N DE LA EXPRESI�N DE LOS GENES VIRALES
Cuando una c�lula es infectada por un virus, no todos los genes virales son expresados a un mismo tiempo y, por lo tanto, no todas las prote�nas virales son sintetizadas al mismo tiempo. La mayor�a de estas prote�nas virales no son sintetizadas en forma continua. Algunas prote�nas virales son sintetizadas durante unos cuantos minutos al principio de la infecci�n, otras son sintetizadas en las etapas tard�as de la infecci�n y otras m�s son sintetizadas durante periodos que equivalen a la mitad del ciclo infeccioso.
Cuando se expresa un gene, la informaci�n gen�tica presente en la secuencia
de nucle�tidos del �cido nucleico original es transcrita en una secuencia complementaria
constituida por ARN mensajero, la informaci�n contenida en este
ARN mensajero es traducida en el interior de las estructuras conocidas
como ribosomas; en esta traducci�n interviene otro tipo de ARN
conocido como ARN de transferencia (ARNt), del cual
existen cuando menos veinte tipos diferentes, cada tipo de ARNt
sirve para transportar espec�ficamente uno de los veinte tipos diferentes de
amino�cidos que forman parte de las prote�nas. La traducci�n consiste en interpretar
los codones constituidos por tripletas de nucle�tidos presentes en la secuencia
del ARN mensajero (ARNm). Existen 61 codones diferentes
que codifican a los 20 amino�cidos diferentes, o sea, que un mismo tipo de amino�cido
puede ser designado por m�s de un cod�n. Adem�s, existen otros tres codones
cuya funci�n es actuar como signos determinaci�n en la s�ntesis de prote�nas.
Cada cod�n (con excepci�n de aquellos que act�an como signos de terminaci�n)
es reconocido por su respectivo anticod�n, constituido por una tripleta de nucle�tidos
con secuencia complementaria a la del cod�n; este anticod�n se encuentra en
un extremo de la mol�cula del ARNt correspondiente. As�, el producto
de la traducci�n est� constituido por una cadena de amino�cidos, o sea, una
prote�na cuya secuencia de amino�cidos es correspondiente a la secuencia de
codones presente en el ARNm, secuencia interpretada por los anticodones presentes
en los ARNt que act�an como transportadores de los amino�cidos.
i) Regulaci�n en los bacteri�fagos ADN
El control de la expresi�n gen�tica puede ocurrir en el nivel de la transcripci�n,
en el nivel de la traduccion o en ambos niveles. En el caso de las bacterias
infectadas por fagos ADNADN en ARNm es realizada por la enzima ARN
polimerasa, la cual en bacterias como la E. coli est� formada por cien
diferentes cadenas polipept�dicas (prote�nas): a, b, bws;
estas prote�nas est�n unidas entre s� por puentes de hidr�geno en la siguiente
proporci�n: a, b, bws La prote�na o factor s
puede ser f�cilmente separada del resto de la ARN polimerasa que
retiene la actividad catal�tica encargada de la s�ntesis del ARNm.
El factor s tiene como funci�n el reconocimiento de las se�ales para la iniciaci�n
de la transcripci�n; estas se�ales est�n presentes en las llamadas secuencias
promotoras incluidas en el ADN.
Durante la infecci�n de una bacteria por fago T7 se forma una serie de mol�culas
discretas de ARNARNARNm temprano, el cual consta de 4 especies;
y ARNm tard�o, que consta de 8 o 9 especies diferentes. En el fago
T7 solamente una de las cadenas del ADN viral sirve como templado
para la s�ntesis de ARNm esto indica que los genes de este fago
est�n codificados en la misma cadena de ADNARNARN polimerasa de la bacteria hospedera.
La ARNARNARN
polimerasa bacteriana se encarga de transcribir los llamados genes tempranos
del genoma viral. Este primer tipo de ARNm producido es de tipo
policistr�nico, o sea, incluye en una sola mol�cula de ARNm el
mensaje contenido en varios genes. Sin embargo, una enzima ribonucleasa propia
de la c�lula bacteriana (ARNasa III) corta e saje correspondiente
a un solo gene en particular. Como ya fue mencionado, la transcripci�n del gene
1, y su posterior traducci�n, resulta en la s�ntesis de una ARN
polimerasa viral que se encarga de transcribir los llamados genes virales tard�os.
La transcripci�n de cada clase o tipo de ARN
El fago T7 inhibe las funciones sint�ticas propias de la c�lula bacteriana.
Una prote�na codificada por uno de los genes tard�os del fago T7 es capaz de
pegarse a la ARN ARNm
bacteriano y eliminando de paso la s�ntesis de nuevas mol�culas de ARNm
viral de tipo temprano. El genoma del fago T7 tiene un peso molecular de
25 x 106 daltones y una capacidad de codificaci�n
equivalente a 30 genes de tama�o promedio. Hasta la fecha han sido identificados
25 genes de este tipo de virus; estos genes han sido ordenados en un mapa gen�tico
lineal en el cual los genes que se expresan en forma temprana est�n concentrados
en el extremo del genoma (ADN) viral. Por lo tanto, considerando
que la s�ntesis de ARNm ocurre en la direcci�n 5' � 3', resulta
que los transcritos correspondientes a los genes tempranos est�n concentrados
en el extremo 3' del ARNm viral.
En el caso de la infecci�n por fago T4, es posible identificar tres clases
de ARNARNm
tempranos inmediatos, ARNm tempranos tard�os y ARNARNm tempranos inmediatos son sintetizados durante
el primer minuto de infecci�n. Los ARNm tempranos tard�os son sintetizados
a partir de 2 o 3 minutos despu�s de iniciada la infecci�n. Los ARNARNm dd
fago T4 es sensible al antibi�tico rifampicina. Es sabido que este antibi�tico
afecta a la subunidad b, de la ARN polimerasa,
bacteriana; por lo tanto, esta subunidad debe participar en la s�ntesis del
ARNm del fago T4. Experimentos en los cuales la ARN
polimerasa bacteriana ha sido marcada radiactivamente antes de la infecci�n
por fago T4, indican que las subunidades a y
b, de la ARN polimerasa son conservadas durante el ciclo
de infecci�n; sin embargo estas subunidades son modificadas. Dos minutos despu�s
de iniciada la infecci�n ocurre una modificaci�n de las subunidades de la ARN
polimerasa bacteriana por medio de un proceso conocido como adenilaci�n; esto
modifica la especificidad de la enzima que suspende la s�ntesis de ARNm
viral de tipo temprano inmediato y empieza a sintetizar ARNm viral
de tipo temprano tard�o. Existe evidencia de que a los 10 minutos de infecci�n
la estructura de la subunidad b,' es modificada;
esto resulta en un nuevo cambio en la especificidad de la ARN polimerasa,
la cual empieza a sintetizar ARNm virales tard�os. Existen otros
factores que tambi�n participan en la regulaci�n de la transcripci�n del fago
T4; entre �stos podemos mencionar: la s�ntesis de un factor de naturaleza proteica
capaz de hacer antag�nica la normal terminaci�n de las cadenas de ARNm
(factor de antiterminaci�n), este factor permite que la ARN polimerasa
bacteriana contin�e transcribiendo el ADN viral hasta llegar a
los genes distales. Tambi�n ocurre la s�ntesis de factores similares al factor
s, capaces de reconocer se�ales de iniciaci�n de la transcripci�n que no son
reconocidas normalmente por el factor o propio de la bacteria hospedera.
Figura III.8. Esquema de una c�lula bacteriana (procariote).
ii) Regulaci�n en los virus animales
La regulaci�n de la expresi�n gen�tica de los virus animales puede ocurrir
en el nivel de la transcripci�n, traducci�n o de ambos procesos, y en un grado
que var�a entre los diferentes tipos de virus y tambi�n durante el ciclo de
multiplicaci�n de cada virus en particular. La investigaci�n de los virus animales
ha permitido elucidar mecanismos de regulaci�n gen�tica, totalmente diferentes
a los presentes en los sistemas bacterianos. En muchos casos todav�a se ignora
la mayor�a de los eventos involucrados en la regulaci�n de los genes virales.
Sin embargo, el estudio de los virus animales ha servido como poderosa herramienta
para conocer detalles de la biolog�a molecular de las c�lulas eucari�ticas,
o sea, c�lulas que se caracterizan por tener n�cleo y otros organelos intracelulares
a diferencia de las c�lulas procari�ticas (como las bacterias) que carecen de
organelos intracelulares (figuras III.8 y III.9).
Figura III.9. Esquema de una c�lula animal (eucariote).
El genoma completo del virus de la polio, un tipo de virus ARNARN perteneciente a la clase IV de la clasificaci�n de Baltimore;
estos virus se caracterizan por producir un ARNm cuya secuencia
es id�ntica a la del ARN que constituye el genoma viral; para esto
se requiere la s�ntesis previa de una cadena de ARN con secuencia
complementaria a la del ARN del genoma viral. Esta cadena complementaria
sirve como templado para la s�ntesis del ARNm viral. El virus de
la polio es capaz de inhibir la s�ntesis de macromol�culas propias de la c�lula
hospedera, de esta manera todos los recursos y precursores moleculares presentes
en la c�lula son dedicados a la producci�n de componentes virales y, por lo
tanto, no resulta sorprendente que la c�lula muera a consecuencia de la infecci�n
viral. En las c�lulas infectadas por el poliovirus una de las prote�nas virales
introducida a la c�lula junto con el viri�n es la causa de que se inicie la
inhibici�n de las funciones celulares. Particularmente es afectada la s�ntesis
del ARN
Figura III.10. Esquema de la s�ntesis de las prote�nas del virus de la poliomielitis.
Los picornavirus hacen sus prote�nas funcionales por medio de la traducci�n
del ARN mensajero viral en una cadena continua de amino�cidos (la
poliprote�na NOO=. durante la s�ntesis de esta poliprote�na se producen cortes
primarios que dan origen a las prote�nas precursoras N1, NX y N1.5. Ni es fragmentada
para formar las prote�nas estructurales del viri�n, mientras que NX y los productos
del N1.5 probablemente est�n involucrados en funciones intracelulares como l
a s�ntesis de ARN viral.
En el caso de los virus ARNARNARNARNm(+), que es traducido en prote�nas, y el ARN(+),
que sirve como templado para la s�ntesis de nuevos genomas virales constituidos
por ARN(-). Recordemos que por convenci�n el ARNm
es (+) y todo �cido nucleico de secuencia complementaria a la de dicho ARNARN(+): el ARN(+)
que servir� como templado para la s�ntesis del ARN(-) viral es
un fiel complemento de la secuencia de nucle�tidos presente en el genoma ARN(-)
viral, mientras que el ARNm(+) viral carece de una porci�n de la
secuencia de nucle�tidos complementaria al extremo 5´ del ARN(-)
correspondiente al genoma viral. As�, el ARNm no puede servir como
templado para la s�ntesis de segmentos completos del genoma viral.
Los ortomixovirus son �nicos entre los virus ARN debido a que
parte de su ciclo de multiplicaci�n se lleva a cabo dentro del n�cleo celular.
Inmediatamente despu�s de la infecci�n, la part�cula viral desnuda es transportada
al interior del n�cleo celular y en etapas m�s avanzadas de la infecci�n, algunas
prote�nas virales reci�n sintetizadas migran del citoplasma (su lugar de s�ntesis)
hacia el n�cleo. El paso de mol�culas a trav�s de la membrana nuclear es un
proceso altamente selectivo y constituye un nivel de control presente �nicamente
en las c�lulas eucari�ticas.
Todos los virus ADN, con excepci�n de los poxvirus, sintetizan
su ARNm a partir de una mol�cula de ADN de cadena doble, la cual
se ubica en el n�cleo de la c�lula infectada y, por lo tanto, representa el
modelo m�s cercano para el estudio de la s�ntesis de ARNm en las
c�lulas eucari�ticas. Las histonas constituyen el principal tipo de prote�nas
que normalmente se encuentran asociadas con el ADN celular; estas
histonas se encuentran tambi�n asociadas con el genoma de algunos virus ADN
como los papovavirus, lo que subraya la similitud estructural entre la cromatina
celular y la cromatina viral. El tama�o de los genomas de los virus ADN
animales var�a dos �rdenes de magnitud, desde los parvovirus, cuyo ADN
tiene un peso molecular promedio de 1.5 x 106
daltones, hasta el virus de la vacuna cuyo ADN tiene un peso molecular
de 160 x l06daltones. Los virus m�s
grandes son menos dependientes de las funciones de la c�lula hospedera para
multiplicarse y por lo tanto pueden hacerlo aun cuando las c�lulas hospederas
se encuentran fuera de la fase S del ciclo celular, misma que constituye el
periodo normal de duplicaci�n del ADN celular. Los virus peque�os
solamente pueden replicarse durante la fase S del ciclo celular; y los virus
de tama�o intermedio tienen la capacidad de inducir a la c�lula para que entre
en la fase S. Casi todos los virus ADN tienen la capacidad de transformar
c�lulas en cultivo, volvi�ndolas de tipo tumoral (canceroso). Este fen�meno
ser� discutido con detalle m�s adelante. Sin embargo, es posible especular que
la transformaci�n celular puede resultar a consecuencia de una aberraci�n en
el mecanismo normal por medio del cual el virus interacciona con los factores
celulares que regulan la divisi�n celular. Tambi�n es importante mencionar que
gran parte de la informaci�n gen�tica contenida en el genoma de los virus ADN
m�s grandes parece duplicar informaci�n ya presente y expresada en las c�lulas
que se encuentran en la fase S del ciclo celular.
v) Regulaci�n en los papovavirus
Los papovavirus constituyen un grupo de virus ADN animales. El virus del polioma y el virus de simios SV40 son los papovavirus m�s estudiados. Estos virus tienen un genoma circular constituido por ADN de cadena doble que codifica prote�nas virales tempranas y tard�as, las cuales son sintetizadas a partir de la traducci�n de ARNm virales tempranos y tard�os. El ADN de los papovavirus es transcrito por la ARN polimerasa celular tipo II, la cual normalmente es la encargada de sintetizar el ARNm celular. El ARNm viral de tipo temprano es sintetizado a partir de una cadena de ADN diferente a la que da origen al ARNm tard�o. En el virus SV40, la prote�na temprana m�s importante es el ant�geno tumoral mayor o T-ant�geno; esta prote�na viral migra hacia el n�cleo celular y supuestamente modifica el ADN celular, de manera que se vuelve susceptible a ser replicado. El virus SV40 tambi�n sintetiza otro ant�geno tumoral menor o t-antigeno. Por su parte, el virus del polioma sintetiza tres diferentes ant�genos tumorales. El papel de estos ant�genos en la transformaci�n celular ser� discutido m�s adelante.
Otras prote�nas tempranas codificadas por el virus SV40, pero cuya funci�n se desconoce, son el U-ant�geno, que tambi�n se ubica en el n�cleo celular, y el ant�geno de transplante-tumor espec�fico (TSTA), que se ubica en la membrana celular. La fase inicial de la infecci�n viral es seguida por la inducci�n de la s�ntesis de enzimas celulares y ADN celular, en forma independiente de las necesidades celulares. A continuaci�n se inicia la s�ntesis de ADN viral seguida por la s�ntesis de ARNm viral tard�o. Las prote�nas tard�as son ensambladas con el ADN viral para formar los nuevos viriones. A pesar de que los ARNm tempranos y tard�os son sintetizados a partir de diferentes cadenas del ADN viral, ambos tipos de ARNm est�n presentes en el n�cleo de la c�lula infectada, incluso en las etapas avanzadas de la infecci�n. Por lo tanto, la s�ntesis predominante de prote�nas virales tard�as se logra por medio del transporte selectivo hacia el citoplasma de aquellos transcritos de ARNm viral que corresponden a las prote�nas de tipo tard�o.
vi) Regulaci�n en los adenovirus
Figura III. 11. (a) Producci�n del ARN mensajero de un adenovirus. (b) El
asa de ADN formada por el apareamiento con el ADN gen�mico puede ser observada
mediante el microscopio electr�nico y proporciona evidencia de que el ARNm es
formado a partir de regiones no contiguas del ADN gen�mico. En la ilustraci�n
solamente est� representada una cadena del ADN.
Los adenovirus poseen una cantidad de ADN seis veces mayor que la de los papovavirus. Sin embargo, son muy similares sus estrategias de control gen�tico: s�ntesis temprana de prote�nas virales, replicaci�n del ADN viral, s�ntesis de prote�nas virales tard�as. En el caso de los adenovirus, tanto la ARN polimerasa celular tipo II como la tipo III participan en la transcripci�n de ARNm viral temprano y tard�o. El estudio de la replicaci�n de los adenovirus ha contribuido a establecer que el ARNm de ciertos virus es codificado, al igual que el ARNm de las c�lulas eucari�ticas, por regiones no contiguas del ADN. Esto implica que el transcrito inicial del ARN viral es fragmentado en forma espec�fica y los fragmentos adecuados son unidos por una enzima ARN ligasa (figura III.11). En el n�cleo de la c�lula infectada por el adenovirus ocurren mecanismos de control gen�tico altamente complejos. Adem�s de la fragmentaci�n y ligado del ARNm, existen otros procesos como la poliadenilaci�n, que consiste en la adici�n de un pol�mero constituido por 150 a 200 nucle�tidos de adenina, al extremo 3' del ARNm. Este fen�meno incrementa la estabilidad del ARNm. Otro proceso es el capping del ARNm viral, el cual consiste en la adici�n de un nucle�tido especial: 7-metil guanosina, al extremo 5' del ARNm. Este nucle�tido puede ser hipermetilado posteriormente. El cap protege el extremo 5' del ARNm evitando que sea degradado por enzimas nucleasas o fosfatasas o por ambas, lo cual incrementa la estabilidad del mensaje. Tambi�n se observa un transporte diferencial del ARNm viral en el nivel de la membrana nuclear; la permeabilidad de esta membrana al ARNm reci�n sintetizado cambia continuamente durante el proceso de infecci�n, de manera que el espectro de prote�nas virales al ser sintetizadas tambi�n cambia en forma continua.
vii) Regulaci�n en los herpesvirus
Los herpesvirus contienen aproximadamente cuatro veces m�s ADN que los adenovirus.
En los herpesvirus la s�ntesis de ARNm tard�os es independiente de la s�ntesis
de ADN viral y celular. As�, cuando se inhibe la s�ntesis de ADN, todav�a es
posible observar la acumulaci�n de ARNm temprano y tard�o en el n�cleo celular.
Sin embargo, la s�ntesis de las prote�nas virales sigue un riguroso sistema
de inducci�n y represi�n que ocurre en tres fases. Las prote�nas de tipo a
son las primeras en ser sintetizadas despu�s del inicio de la infecci�n; estas
prote�nas a inducen a su vez la s�ntesis de
las prote�nas virales b las cuales reprimen
la s�ntesis de las prote�nas a e inducen la
s�ntesis de las prote�nas virales g, las cuales
a su vez reprimen la s�ntesis de las prote�nas b.
La evidencia disponible indica que los mecanismos de control en la s�ntesis
de estas prote�nas virales ocurre en el nivel de la traducci�n y el procesamiento
de los ARNm virales dentro del n�cleo de la c�lula infectada.
En el caso del virus Herpes simplex tipo 1, existe evidencia reciente de que la infecci�n viral produce un n�mero limitado de rupturas en las cadenas del ADN celular; estas rupturas inducen un cambio en la estructura tridimensional de este ADN celular y en las relaciones o asociaciones que mantiene este ADN celular con el n�cleo-esqueleto o estructura subnuclear. El desprendimiento del ADN celular de los sitios de anclaje a la subestructura nuclear se manifiesta entre otras cosas por la inhibici�n de la s�ntesis del ARN y ADN celulares. Al parecer, la posici�n que guardan las asas de ADN celular en relaci�n con la subestructura nuclear tiene un papel muy importante en la potencialidad de este ADN para ser replicado y transcrito. La alteraci�n en la posici�n del ADN celular inducida por la infecci�n viral puede ser un mecanismo econ�mico y eficiente para lograr la inhibici�n de la s�ntesis de macromol�culas celulares.
viii) Regulaci�n en los poxvirus
Los poxvirus que incluyen al virus de la viruela y de la vacuna son los �nicos virus ADN animales que se multiplican en el citoplasma de la c�lula infectada. Tambi�n son los virus m�s grandes y tienen capacidad para codificar 50 veces m�s genes que los papovavirus. El sitio de la multiplicaci�n viral en el citoplasma se manifiesta por la virtual formaci�n de un "se gundo n�cleo". Los viriones de los poxvirus contienen una multitud de enzimas cuyas actividades son un duplicado de aquellas normalmente presentes en el n�cleo celular. Estos viriones poseen su propia ARN polimerasa dependiente de ADN al igual que enzimas capaces de adenilar, metilar y a�adir cap a los ARNm virales. La presencia de control en el nivel de la traducci�n es evidente en la s�ntesis de la enzima viral timidina cinasa, la cual es una prote�na temprana cuya s�ntesis se detiene una vez que aumenta la s�ntesis de prote�nas virales tard�as, algunas de las cuales parecen ser la causa de la inhibici�n de la s�ntesis de prote�nas tempranas como la timidina cinasa.
En las c�lulas infectadas por virus tanto las prote�nas como los �cidos nucleicos virales son sintetizados por separado y posteriormente ensamblados para formar nuevas part�culas virales. Los virus pueden autoensamblarse en un proceso similar a la cristalizaci�n, ya que las part�culas virales, al igual que los cristales, constituyen estructuras que se encuentran en un estado m�nimo de energ�a libre. Sin embargo, el genoma viral tambi�n puede especificar ciertos factores "morfogen�ticos" que no contribuyen directamente a formar la estructura del viri�n, pero son necesarios para el proceso de ensamblaje.
El fen�meno de autoensamblaje ocurre en la formaci�n de diversas estructuras biol�gicas como los flagelos celulares. Sin embargo, el ejemplo mejor estudiado es la reconstituci�n in vitro del virus del mosaico del tabaco. Este virus consta de un largo filamento helicoidal de ARN que est� incluido en una estructura constituida por peque�as subunidades id�nticas de prote�na "A"; estas subunidades est�n dispuestas en forma helicoidal. Las prote�nas del VMT forman diferentes tipos de agregados moleculares cuando se encuentran en soluci�n, dependiendo de las condiciones ambientales, particularmente la fuerza i�nica y el pH. Las estructuras discoidales son el tipo m�s com�n de agregado proteico que ocurre bajo condiciones fisiol�gicas. Sin embargo, la interacci�n de los discos de prote�na con el ARN viral resulta en la estabilizaci�n de la forma helicoidal. Cuando se mezclan subunidades de prote�na "A" y ARN viral, la polimerizaci�n es lenta y la formaci�n de viriones maduros requiere de casi seis horas. Cuando se mezclan los discos de prote�na "A" con ARN viral bajo las mismas condiciones del experimento anterior, la polimerizaci�n es r�pida y en cinco minutos se ensamblan viriones maduros.
El modelo m�s aceptado para explicar el ensamble del VMT es el asa en movimiento.
Este modelo propone que una mol�cula de ARN en forma de horquilla
se inserta, a trav�s del orificio central de un disco formado por subunidades
de prote�na "A", en el espacio o mand�bula presente entre los dos discos de
prote�na "A". A consecuencia de esta interacci�n, los discos son desfasados
dando origen a una estructura helicoidal, la cual se perpet�a por medio de la
adici�n de nuevos discos de prote�na en la parte superior de la h�lice en crecimiento.
El asa producida por la tracci�n del ARN hacia arriba del orificio
central de la part�cula en crecimiento constituir� el asa en movimiento que
se inserta en el orificio del siguiente disco adicional, desfas�ndolo a su vez
y convirti�ndolo en una estructura helicoidal (figura III.12). Este modelo predice
que en part�culas de VMT ensambladas parcialmente las puntas 5' y 3' del ARN
viral deben protuir a trav�s de alguno de los extremos de la part�cula viral
en formaci�n. Este hecho ha sido confirmado por microscopia electr�nica.
El ensamble dirigido de los nuevos viriones es caracter�stico de virus complejos como los fagos del grupo T. El caso m�s estudiado es el del fago T4. El primer avance en la elucidaci�n del ensamblaje del fago T4 se obtuvo a partir del estudio de mutantes letales condicionales. Cuando se infecta una cepa no permisiva de E. coli con fagos que tienen mutaciones en cualquiera de sus genes estructurales, no se producen nuevas part�culas virales. Sin embargo, cuando se examinan bajo el microscopio electr�nico los lisados obtenidos a partir de estas bacterias infectadas con fagos mutantes, se encuentra la presencia de estructuras correspondientes a los componentes del fago. As�, bacterias infectadas con fagos mutantes en el nivel de los genes 34, 35, 36, 37 y 38, acumulan part�culas virales que parecen normales, salvo porque carecen de las fibras de la cola. Por lo tanto, se concluye que estos genes codifican proteas involucradas en el ensamble de las fibras de la cola; la adici�n de estas fibras es un evento tard�o en el ensamble de las nuevas part�culas virales. Las fibras se acuman en bacterias infectadas con fagos mutantes en los genes 34, 35, 36 y 38, pero no en los mutantes en el gene 37, por lo que se deduce que este gene 37 codifica la principal prote�na estructural de las fibras de la cola del fago. La aplicaci�n de esta metodolog�a a bacterias infectadas con otras cepas diferentes de fagos mutantes permiti� identificar la funci�n de muchos otros genes del fago T4y establecer que la cabeza, la cola y las fibras del fago son sintetizadas en forma independiente.
Figura III. 12. Modelo de asa en movimiento para el ensamble del virus del
mosaico del tabaco (VMT). La nucleaci�n se inicia con la inserci�n de una horquilla
de ARN viral en el orificio central del primer disco de prote�nas tipo "A".
El asa se intercala entre dos capas de subunidades y se pega alrededor de la
primera vuelta del disco. Como resultado del modo de iniciaci�n, el extremo
m�s largo del ARN viral forma un asa en movimiento a la cual se le a�aden r�pidamente
discos adicionales formados por subunidades de prote�na "A".
Figura III.13. Ensamble del bacteri�fago T.4
Estudios complementarios realizados in vitro han permitido conocer m�s detalles del proceso de ensamblaje del fago T4. Por ejemplo, fagos carentes de fibras aislados a partir de bacterias infectadas con mutantes en los genes 34-38 fueron mezclados con un extracto obtenido de bacterias infectadas con una cepa de fagos mutantes en el gene 23, la cual no puede sintetizar cabezas virales. El resultado de este experimento fue la formaci�n in vitro de viriones completos e infectivos, ya que el extracto del mutante en el gene 23 actu� como donador de fibras de la cola, mientras que el otro extracto proporcion� las cabezas del fago. Este tipo de experimento es an�logo a los estudios de complementaci�n gen�tica, pero con la diferencia de que estos �ltimos se realizan in vivo, o sea, dentro de las c�lulas infectadas.
La figura III.13 muestra la secuencia de ensamble del fago T4. Los productos de los genes 13 y 14 no est�n involucrados directamente en el proceso de uni�n; sin embargo, deben ser funcionales para que pueda ocurrir la uni�n entre cabezas y colas. Las cabezas se unen a las colas en forma espont�nea; por lo tanto, los genes 13 y 14 deben estar involucrados en alguna modificaci�n de las cabezas maduras, la cual es un prerrequisito para la adici�n de la cola. En contraste, las fibras de la cola no se unen espont�neamente a la placa basal, sino que requieren la participaci�n activa del producto del gene 63 para poder llevar a cabo esta uni�n.
El correcto ensamblaje de muchos virus esf�ricos y tambi�n de algunos fagos con cabeza y cola requiere la participaci�n de prote�nas que no est�n presentes en el virus maduro. A estas prote�nas se les conoce como prote�nas formadoras del andamio. Por ejemplo, durante el ensamble del fago P22 aproximadamente 250 mol�culas de las prote�nas del andamio catalizan el ensamble de 420 mol�culas de la prote�na de la cubierta viral, de manera que estas prote�nas forman una procabeza de cubierta doble, la cual contiene ambos tipos de prote�na. Cuando ocurre la encapsidaci�n del ADN viral, todas las prote�nas formadoras del andamio son expulsadas de la procabeza, de manera que estas prote�nas quedan libres para participar en ciclos subsecuentes de ensamble de las procabezas. En el caso del fago T4, la prote�na formadora del andamio es el producto del gene 22; esta prote�na es removida de la procabeza por medio de una enzima proteol�tica (capaz de degradar prote�nas) en el momento que ocurre la encapsidaci�n del ADN viral.
Durante el ensamblaje de los adenovirus las prote�nas formadoras del andamio son eliminadas en el momento que ocurre la encapsidaci�n del ADN viral, pero no se sabe si estas prote�nas son destruidas o reutilizadas en el ensamble de otras part�culas virales. Existe evidencia de que en el proceso de ensamble de los herpesvirus y los poxvirus se reciclan las prote�nas formadoras del andamio.
La prote�na codificada por el gene B del fago ØXI74 no est� presente en el viri�n maduro, pero participa en forma catal�tica en el ensamble del fago. En c�lulas infectadas por ØXI74, la prote�na del gene F se agrega para formar pent�meros al igual que la prote�na del gene G; estos pent�meros reaccionan en presencia del producto del gene B para formar un agregado proteico m�s complejo, el cual probablemente constituye los v�rtices de la c�pside viral icosa�drica.
h) FRAGMENTACI�N DE PROTE�NAS VIRALES
En la mayor�a de los casos estudiados, la formaci�n de viriones maduros requiere la fragmentaci�n de grandes prote�nas precursoras una vez que �stas se han ensamblado para formar procabezas o proviriones. Por ejemplo, en la maduraci�n de la cabeza del fago T4, la prote�na producto del gene 23 (p23) es fragmentada para generar la prote�na p23*, que es 17% m�s corta que p23. En ausencia del �cido nucleico, las prote�nas �ntegras forman agregados m�s estables que las prote�nas fragmentadas. Esto es consistente con la observaci�n de que la fragmentaci�n de las prote�nas estructurales ocurre justamente antes de la encapsidaci�n del �cido nucleico viral.
En las c�lulas infectadas por picornavirus y togavirus ocurren dos tipos de fragmentaci�n postraducci�n de las prote�nas virales. Por ejemplo, el genoma completo del poliovirus es traducido en un solo polip�ptido gigante, el cual es fragmentado en tres polip�ptidos m�s peque�os. Uno de estos polip�ptidos es la prote�na NCVPl o prote�na que pertenece a la c�pside viral. Esta prote�na es precursora de las cuatro prote�nas presentes en el viri�n maduro. NCVPl se deriva de la regi�n 5' del genoma viral y es sintetizada en forma completa antes de ser fragmentada; esto sugiere que es necesario que la prote�na NCVPl se pliegue en el espacio para adquirir una conformaci�n tridimensional antes de que ocurra la fragmentaci�n de dicha prote�na. La fragmentaci�n de NCVPl da origen a las prote�nas VPO, VPl y VP3, las cuales se encuentran asociadas entre s� en el interior de las c�lulas infectadas al igual que en las c�psides virales. Despu�s de que el ARN viral es encapsulado, VPO es fragmentada para producir las prote�nas del viri�n denominadas VP2 y VP4. La fragmentaci�n inicial del producto primario de la traducci�n del genoma viral representa un caso de fragmentaci�n formativa. Este proceso probablemente constituye un mecanismo utilizado por las c�lulas animales como substituto para la iniciaci�n interna de la s�ntesis de prote�nas en mensajes policistr�nicos (mensajes que contienen la informaci�n correspondiente a varios genes). La fragmentaci�n del NCVPl en VPO, VP1 y VP3, y la subsecuente fragmentaci�n de VPO en VP2 y VP4, representan ejemplos de fragmentaci�n morfogen�tica (figura III.10).
i) ENSAMBLE DE LOS VIRUS CON ENVOLTURA
Un gran n�mero de virus, particularmente de virus animales, poseen una envoltura
lip�dica como parte de su estructura. Por ejemplo, los herpesvirus se replican
en el n�cleo celular y aunque las prote�nas virales son sintetizadas en el citoplasma
celular, estas prote�nas son reintroducidas al n�cleo celular. Despu�s del ensamble
de la nucleoc�pside, el virus brota a trav�s de la membrana nuclear y de esta
manera adquiere la envoltura. Antes de que ocurra este proceso, la membrana
nuclear es modificada por medio de la incorporaci�n de prote�nas virales espec�ficas,
las cuales son glicosiladas, o sea, se les a�aden mol�culas de carbohidratos.
Sin embargo, la gran mayor�a de los virus con envoltura la adquieren a partir
de la membrana celular. Se han identificado cuatro eventos principales en la
maduraci�n de estos virus. Primero, se forma la nucleoc�pside en el citoplasma
celular. Segundo, ciertas �reas de la membrana celular incorporan glicoprote�nas
virales. Tercero, la nucleoc�pside se alinea a lo largo de la superficie interna
de la membrana modificada y finalmente brota de la c�lula. Durante este proceso,
ninguna prote�na de la membrana celular es incorporada en las part�culas virales,
aunque la mayor parte de los l�pidos presentes en la envoltura viral son derivados
de los l�pidos normalmente presentes en la membrana de la c�lula hospedera.
