I. EL SUPLICIO DE T�NTALO O LA HEBRA INACCESIBLE

El panorama antes del ADN recombinante

TODOS hemos escuchado hablar del t�rmino ingenier�a gen�tica. Los medios de informaci�n nos bombardean con descripciones de descubrimientos asombrosos, y en ocasiones, plantean escenarios de desastre, propiciados por una maligna intervenci�n del hombre para alterar la naturaleza. En realidad, si lo meditamos con cuidado, el ser humano siempre ha interferido con los procesos naturales propios y de otras especies. �De d�nde proviene, si no, la gran variedad de razas caninas, por ejemplo? �Y no era un serio intrometimiento con el proceso practicar repetidas sangr�as al enfermo a la menor provocaci�n? La administraci�n de antibi�ticos para salvar innumerables vidas humanas, �no significa una definitiva interferencia con los procesos naturales? Lo que s� resulta claro es que la capacidad de manipulaci�n, no siempre basada en el conocimiento, est� aumentando continuamente. En particular, durante los �ltimos 15 a 20 a�os ha sido notable un avance sin precedente en el campo de las ciencias biol�gicas. Esto se debe fundamentalmente al surgimiento de las t�cnicas de ingenier�a gen�tica o ADN recombinante.¹

Una caracter�stica importante de la ciencia biol�gica es que constituye una �rea de conocimiento relativamente nueva. �A qu� se debe esto? �C�mo es, nos preguntamos, que en la era espacial y de las computadoras, no sabemos curar ni un catarro com�n? Parte de la respuesta estriba en la inmensa complejidad de cualquier sistema biol�gico. La c�lula m�s simple est� constituida por cientos de miles de mol�culas diferentes, que son entidades peque��simas, en continua transformaci�n. Existe adem�s un constante dinamismo en la composici�n del material viviente, mediado por interacciones moleculares de incre�ble sutileza, sujetas a una compleja y estricta regulaci�n. Por esta raz�n, se requirieron instrumentos propios de la era tecnol�gica (por ejemplo, el microscopio), para empezar a atisbar en la estructura de estos sistemas. Se ha requerido del avance concertado de la f�sica, la qu�mica, la ciencia de materiales, y del progreso econ�mico para poder acceder a la tecnolog�a necesaria para el estudio de los sistemas vivientes. Otro hecho destacado es que la investigaci�n cient�fica tiene la particularidad de ir acumulando preguntas que no es posible resolver con la tecnolog�a del momento; pero en cuanto �sta progresa, se agolpan las soluciones de muchas preguntas y, r�pidamente, surgen otras nuevas. Una de estas t�cnicas o metodolog�as, que establece un parteaguas en la capacidad de indagaci�n sobre los seres vivos es, precisamente, la ingenier�a gen�tica.

Para entender cabalmente la importancia central de esta nueva metodolog�a es �til revisar algunos conceptos b�sicos sobre las mol�culas de la vida y lo que se conoc�a antes de que surgiera esa disciplina.

LAS MOL�CULAS DE LA VIDA

A trav�s de varios miles de millones de a�os de evoluci�n, la diversidad biol�gica nos resulta apabullante y asombrosa. Cada organismo vivo, desde un ser humano hasta una peque�a planta, una bacteria o una mosca, parece ser una invenci�n �nica y diferente. Si observamos con cuidado, sin embargo, detectamos muchos elementos en com�n. La clasificaci�n de los seres vivos en reinos, �rdenes, g�neros, etc., obedece precisamente a esta clara noci�n de que los organismos vivos se parecen unos a otros. En el nivel molecular, los seres vivos se parecen increíblemente. Es de la combinaci�n y concierto de interacciones de los mismos tipos de mol�culas que un ser vivo difiere de otro. Esto es similar al caso de las computadoras (especialmente los programas que corren en ellas), que pueden diferenciarse notablemente unas de otras, a pesar de estar constituidas por circuitos o instrucciones muy similares.

Las mol�culas de la vida surgieron hace quiz� 3 ó 4 mil millones de a�os. Sus caracter�sticas y sus interacciones fundamentales han sido alteradas muy poco en todo este tiempo. De manera similar al crecimiento y evoluci�n de una ciudad, un ser vivo no se puede "reinventar" continuamente. La evoluci�n ha ocurrido partiendo de lo que ya hay, con modificaciones paulatinas. En la Roma de hoy distinguimos calles que transit� Julio C�sar; en nuestras c�lulas hay funciones moleculares afines surgidas hace 3 mil millones de a�os.

�Cu�les son estas mol�culas centrales, unificadoras? En lo que resta de este cap�tulo, me propongo describir algunas de ellas, pero antes debo hacer algunas aclaraciones al lector.

Para entender los fen�menos biol�gicos no se requiere, como en otras disciplinas (por ejemplo, la f�sica o la qu�mica), el manejo de conceptos abstractos o el dominio de las matem�ticas. Por otra parte, la complejidad de los sistemas biol�gicos s� necesita un vocabulario especial. M�s a�n, la amplitud y profundidad con la que comprenden hoy los bi�logos la naturaleza es realmente impresionante. Conf�o en que las descripciones de naturaleza t�cnica, inevitables para hablar un lenguaje com�n y para que la presentaci�n del material que nos ocupa no resulte trivial, sean accesibles al lector. Creo que la recompensa de cubrir los pasajes m�s rudos ser� una percepci�n m�s cabal de la belleza y relevancia de los recientes descubrimientos. Como dijera Albert Einstein: "Las cosas deben ponerse tan simples como sea posible. Pero no m�s simples."

�cidos nucleicos

El fen�meno de la herencia es discernible por cualquier observador, pero su fundamento qu�mico-biol�gico no fue siquiera sospechado hasta �pocas relativamente recientes. Por ejemplo, los genes eran entidades abstractas en los trabajos pioneros del monje austr�aco Gregorio Mendel.

La historia de los avances del conocimiento y los experimentos cruciales que dieron origen a la identificaci�n del material gen�tico es extremadamente interesante e ilustrativa. Aunque desde principios de siglo se estudiaban preparaciones biol�gicas con la idea de identificar sustancias responsables de sus notables cualidades, no fue sino hasta los a�os cuarenta que los investigadores estadunidenses Avery, McLeod y McCarty sugirieron, cautelosamente, que el material hereditario podr�a estar contenido en la sustancia llamada �cido nucleico. Durante los siguientes cinco a�os, trabajando con sistemas de separaci�n y an�lisis relativamente primitivos, los investigadores del campo de la gen�tica bioqu�mica demostraron, de manera inequ�voca, que tal era el caso.

El escenario estaba listo para el desarrollo de una de las investigaciones m�s relevantes en la historia de la biolog�a. El multicitado descubrimiento de la estructura tridimensional del �cido desoxirribonucleico (ADN), realizado por Watson y Crick, y cuya culminaci�n fue en 1953, merece siempre una menci�n especial.

Este trabajo muestra varios conceptos que son piedra angular en la investigaci�n biol�gica moderna. En primer lugar, los experimentos realizados se basaron en los adelantos de la f�sica. Se utilizaron rayos X y conceptualizaciones te�ricas para inferir, a partir de patrones de manchas, la estructura de la muestra de ADN analizada (v�ase en el cap�tulo VI una descripci�n m�s extensa sobre la t�cnica de cristalograf�a de rayos X). En segundo lugar, se hace notar la convicci�n de que, de la forma tridimensional de las mol�culas biol�gicas se pueden obtener importantes ideas respecto a la funci�n de las mismas. En tercer lugar, se destaca la confianza de que hay elementos y principios universalmente aplicables a todo ser vivo, cuando se hace el an�lisis a nivel molecular. En su investigaci�n, Watson y Crick reunieron informaci�n sobre las propiedades de difracci�n de rayos X del material recientemente identificado como portador de la herencia. Al utilizar tambi�n datos generados por los qu�micos sobre la naturaleza b�sica de esta mol�cula, se dieron a la tarea de proponer un modelo que fuera consistente con estas observaciones. Los resultados de sus investigaciones fueron publicados en 1953 en la revista Nature, en una sola p�gina. Es as� como hoy d�a sabemos que los genes est�n constituidos por un pol�mero de entidades qu�micas, los nucle�tidos arreglados en forma de escalera de caracol, bautizado con el nombre de �cido desoxirribonucleico (ADN).

La estructura molecular de los �cidos nucleicos sugiri� de inmediato algunas de sus notables propiedades (v�ase el recuadro I.1).

RECUADRO I.1. Estructura y Replicaci�n del ADN   El �cido desoxirribonucleico o ADN, esta formado por dos cadenas. Puede ser descrito como un pol�mero constituido por cuatro diferentes mon�meros. El esqueleto es igual en todos los casos: un azúcar (desoxirribosa) y un fosfato. Del esqueleto se desprenden las bases, que pueden ser A (adenina), G (guanina), C (citosina) o T (timina). Cada una de las cadenas integra una mol�cula, porque está unida por enlaces fuertes (o covalentes), mostrados por medio de l�neas continuas como se muestra en la figura RI.la. La disposici�n de las bases permite, adem�s, que una cadena tenga afinidad por otra, siempre y cuando �sta corra en el sentido opuesto y su secuencia de bases haga que se mantenga la complementariedad entre las bases (A frente a T y G frente a C). Esta afinidad se debe a la formaci�n de enlaces d�biles (no covalentes) llamados puentes de hidr�geno, que se muestran con l�neas punteadas en la figura antes mencionada. Estos enlaces se pueden hacer y deshacer con relativa facilidad. Como puede apreciarse en la figura RI.1b, esto significa que la informaci�n codificada en la secuencia est� duplicada: cada una de las hebras contiene toda la informaci�n. As�, cuando las cadenas se separan, cada una puede servir para regenerar la cadena opuesta. Este proceso se llama replicaci�n, y explica de inmediato c�mo la mol�cula de ADN es capaz de transmitir informaci�n de padres a hijos.

La complementariedad de las bases constituyentes de los �cidos nucleicos permite almacenar y transferir informaci�n. La duplicaci�n de estas mol�culas se basa precisamente en dicha propiedad. Si pensamos detenidamente en las caracter�sticas fundamentales de las mol�culas de ADN, observamos otros aspectos muy interesantes: son mol�culas qu�micamente mon�tonas, como inmensos rosarios con s�lo cuatro tipos de cuentas. El cromosoma de la bacteria m�s simple tiene, por ejemplo, una longitud de alrededor de 600 mil pares de bases; los 23 distintos cromosomas de una c�lula humana contienen mucho m�s ADN: �est�n constituidos por aproximadamente 3 mil millones de pares de bases! Imaginemos que miramos un collar de un mill�n de cuentas de cuatro tipos desde cierta distancia, y que vemos otro, tambi�n de un mill�n de cuentas, arregladas en otro orden. �C�mo podr�amos distinguir uno de otro? Sabemos que hay informaci�n muy valiosa en el orden de esas cuentas, pero, �c�mo tener acceso a ella? Antes del surgimiento del ADN recombinante, la monoton�a qu�mica del ADN constituy� un obst�culo casi infranqueable para el progreso del conocimiento en este campo.

A pesar de lo anterior; por medio de un gran n�mero de experimentos, que no consist�an en la purificaci�n de mol�culas de ADN espec�ficas, ni su caracterizaci�n o an�lisis directo, se pudieron sentar las bases de su funcionamiento fundamental. As� pues, sustent�ndose en pruebas de muchos tipos, se estableci� lo que se ha dado en llamar "dogma central de la biologia molecular" (v�ase el recuadro 1.2).

RECUADRO I.2. La expresi�n de la informaci�n gen�tica   La informaci�n contenida en la secuencia del ADN requiere convertirse en forma y funci�n. El ADN constituye las instrucciones, es decir; los planos; son necesarios herramienta y materiales para ejecutar lo que dicen los planos. La maquinaria celular convierte la informaci�n del ADN en prote�nas espec�ficas, una prote�na por cada gene. As�, un gene no es m�s que un segmento determinado dentro de alguna larga mol�cula de ADN (como una canci�n dentro de la cinta de un casete). La informaci�n fluye del ADN hacia la prote�na, pasando por un intermediario, el ARN (�cido ribonucleico), muy similar al ADN, y con las mismas propiedades de aparamiento que �ste en el proceso llamado transcripci�n, en el cual se van agregando una por una las bases del ARN, copiando la secuencia del ADN. Posteriormente, se ensamblan las mol�culas de prote�na, haciendo corresponder un amino�cido por cada tres bases. Todo un conjunto de mol�culas y organelos participa en este proceso de traducci�n. Hay una correspondencia inequ�voca entre la secuencia del ADN y la de la prote�na para la que codifica, dada por el c�digo gen�tico. Este c�digo relaciona el idioma de cuatro letras de ADN, tomando grupos de tres en tres, con el idioma de las prote�nas, constituido por 20 letras o mon�meros.

El concepto de que la informaci�n fluye de ADN a otra mol�cula similar; el ARN, y de aqu� hacia las prote�nas, hace entrar en escena a los otros actores protag�nicos del conjunto de las macromol�culas biol�gicas: las prote�nas. La breve descripci�n del pr�ximo inciso se refiere a ellas, pero antes de iniciarlo, describiremos otra propiedad fundamental de los �cidos nucleicos: su capacidad de hibridaci�n. Las mol�culas de �cidos nucleicos tienen la propiedad de reasociarse si son separadas y, en general, de encontrar y asociarse con otras mol�culas cuya secuencia sea complementaria. Veamos con m�s cuidado este concepto.

La complementariedad que pueden tener dos hebras de �cido nucleico se puede ilustrar si imaginamos una hebra con la siguiente secuencia: 5�CAGTGAATTCAATCGAT3� y otra con la secuencia 5�ATCGATTGAATTCACTG3� (los n�meros 5� y 3� marcan los extremos de las hebras que corren en sentido antiparalelo, como se ilustra en el recuadro I.1). Estas dos especies moleculares son complementarias, es decir; si las colocamos una frente a otra, en sentido antiparalelo (tal y como se encuentran en las mol�culas de ADN naturales), tenemos:

5�CAGTGAATTCAATCGAT3�

3�GTCACTTAAGTTAGCTA5�

y observamos que frente a C (abajo de la C, en la representaci�n mostrada), hay siempre G y viceversa, y frente a A, hay siempre T, y viceversa.

Podemos hacer dos consideraciones importantes respecto al ejemplo anterior. �Qu� ocurrir�a si colocamos estas dos mol�culas en un mismo tubo de ensayo? �Qu� tan probable es encontrar una secuencia de ADN igual (o complementaria) a otra, dependiendo de su tama�o?

Respecto a la primera consideraci�n se puede predecir que, bajo ciertas condiciones, estas dos mol�culas se unir�an para formar una sola entidad: se aparear�an o hibridar�an. Por lo que toca a la segunda pregunta, podemos hacer un c�lculo simple que nos indica que si tenemos cuatro s�mbolos, para un arreglo o "palabra" de longitud 18, existen 4¹⁸ combinaciones, es decir; unas 68 mil millones. Si se compara con el lenguaje escrito, observamos que, en efecto, las combinaciones de s�mbolos generan muy pronto secuencias �nicas. No nos sorprender�a que, por ejemplo, una frase tal como "en Xochimilco ma�ana" (a pesar de ser una frase corta, que tiene sentido y es correcta) no se encontrara en ninguno de los libros editados por el Fondo de Cultura Econ�mica. Similarmente, en todo el genoma humano, la secuencia de ADN de nuestro ejemplo podr�a no encontrarse. O si se encontrara una vez, ser�a muy poco probable que hubiera una segunda. Esto quiere decir que la propiedad de hibridaci�n confiere a los �cidos nucleicos una capacidad de reconocimiento molecular altamente espec�fica.

Aunque la propiedad de hibridaci�n, o encontrar su complemento, de los �cidos nucleicos fue conocida desde hace mucho tiempo, no fue sino hasta el surgimiento del ADN recombinante que se pudo utilizar como herramienta para detectar secuencias de ADN o ARN (es decir; para aislar y cuantificar genes; v�anse los cap�tulos III y VI).

Prote�nas

Si observamos el proceso de expresi�n del material gen�tico (v�ase el recuadro I.2), observamos que, a partir de un c�digo almacenado en mol�culas qu�micamente mon�tonas (ADN), se obtienen entidades moleculares individuales, que resultan muy distintas unas de otras: las prote�nas. Es notable que en este proceso hay una correspondencia directa, lineal, entre la secuencia de bases del ADN, y la secuencia de amino�cidos de una prote�na (las reglas de correspondencia se conocen como c�digo gen�tico (v�ase el recuadro I.2). La diferencia entre estos dos pol�meros biol�gicos estriba en que, en los �cidos nucleicos los constituyentes o mon�meros son s�lo cuatro, y sus propiedades fisicoqu�micas son muy similares; en cambio, las prote�nas est�n constituidas por 20 tipos distintos de mon�meros, con propiedades fisicoqu�micas muy distintas. La consecuencia de esta diferencia es que los �cidos nucleicos tienden a estructurarse en largas hebras, cuyas propiedades generales son muy parecidas, independientemente de la secuencia. Las prote�nas, por su parte, son mol�culas con gran personalidad fisicoqu�mica.

Al estar constituidas las prote�nas por diferentes amino�cidos, su secuencia determina que la hebra de una de ellas se pliegue en el espacio de manera espec�fica. As�, aunque los genes que contienen las instrucciones (o codifican) para dos prote�nas distintas son estructuralmente muy parecidos entre s�, las dos prote�nas pueden tener estructura, propiedades y funciones totalmente distintas. Las prote�nas se pliegan, obedeciendo a gran n�mero de interacciones, cada una de magnitud relativamente peque�a, para formar estructuras espec�ficas, caracter�sticas de cuya forma depende su funci�n en �ltima instancia (v�ase el cap�tulo VI).

Las prote�nas son, pues, la herramienta de los genes, el brazo ejecutivo de la maquinaria celular; todo lo que existe en la biosfera resulta, en consecuencia, del trabajo concertado y regulado de las prote�nas, dirigidas e interactuando con los genes y con el entorno.

Estas m�quinas moleculares son capaces de llevar a cabo las m�s diversas funciones. Mediante la generaci�n de pol�meros con diversas secuencias, la evoluci�n biol�gica ha producido prote�nas capaces de transportar otras mol�culas (por ejemplo, ox�geno en la hemoglobina de la sangre); de constituirse en materiales resistentes, flexibles o contr�ctiles (pelo, tendones, m�sculos); de transmitir informaci�n y alterar procesos (hormonas como la insulina, toxinas como la causante del t�tanos o venenos de serpientes, ara�as y alacranes); de transformar otras mol�culas al catalizar reacciones qu�micas (enzimas).

Las enzimas son prote�nas que merecen menci�n especial. Dentro de una c�lula viva existen miles de sustancias diferentes, que potencialmente pueden sufrir transformaciones qu�micas muy diversas. De hecho, s�lo algunas de estas reacciones podr�an ocurrir en condiciones suaves y a temperatura ambiente. La c�lula, sin embargo, sufre una constante transformaci�n. Esto se debe al trabajo de las enzimas. Su capacidad catal�tica consiste en que, al interaccionar con sus "mol�culas blanco", es decir; aquellas a las que van a modificar (llamadas sustratos), facilitan transformaciones qu�micas espec�ficas, sin alterarse ellas mismas en el proceso: una enzima cataliza o induce una transformaci�n particular en miles de mol�culas de sustrato sobre las que act�a en forma sucesiva. As�, de la acci�n concertada de las enzimas resulta un proceso continuo de transformaci�n qu�mica, que es el responsable de la aparici�n de forma, funci�n y adaptaci�n al medio.

Es claro, entonces, que en cualquier fen�meno biol�gico las interacciones llevadas a cabo por las prote�nas desempe�an un papel preponderante. De hecho, con gran intuici�n, en 1838, el qu�mico holand�s Gerardus J. Mulder fue quien dio nombre a estas sustancias utilizando la ra�z griega protos, que significa: primordial o "de la mayor importancia". Resulta parad�jico que quiz� la mayor�a de las veces, al escuchar la palabra prote�na, pensamos en un componente de nuestros alimentos, y olvidamos la complejidad y la gran riqueza de funciones e informaci�n que encierran estas mol�culas biol�gicas.

Carbohidratos, l�pidos, esteroides, vitaminas, alcaloides, antibi�ticos...

Ciertamente, cuando hablamos de mol�culas biol�gicas nos referimos a muchos compuestos que no son prote�nas ni �cidos nucleicos. Gruesos tomos de bioqu�mica atestiguan la existencia de los muchos miles de mol�culas y reacciones qu�micas que se llevan a cabo en cualquier ser vivo. Est� por dem�s decir que una descripci�n de todas estas mol�culas y sus funciones est� mucho m�s all� del prop�sito de este libro y de mis capacidades. Creo, sin embargo, que no es arbitrario dedicar m�s espacio a explicar las propiedades de genes y prote�nas, y mencionar solamente que hay innumerables compuestos esenciales que, organizados, transformados y reclutados por las prote�nas, dan lugar al fen�meno de la vida.

SEPARACI�N E IDENTIFICACI�N DE LAS BIOMOL�CULAS

Es usual que mis amigos, muchos de los cuales no son especialistas en ciencia, me pregunten con incredulidad: "bueno, �y c�mo se ve a los genes?", "�c�mo saben que en un tubo de ensayo hay prote�nas?", "�c�mo separan estos materiales, unos de otros?"

Como ya se mencion� anteriormente, es precisamente el avance metodol�gico el que permite responder preguntas y el que despu�s capacita a formular otras nuevas. En la historia del desarrollo cient�fico se puede observar la asombrosa capacidad del ingenio humano para intuir fen�menos que no ha podido observar directamente, y emitir avanzadas hip�tesis respecto al funcionamiento de la naturaleza. Al mismo tiempo, se puede observar que es s�lo mediante el uso de m�todos, a veces extremadamente complejos, y de una tesonera experimentaci�n, que estas hip�tesis se pueden finalmente validar o descartar.

De la descripci�n de algunos de estos m�todos se puede inferir, quiz�, una sensaci�n de lo que es una parte importante del diario quehacer de un cient�fico experimental. De esta misma descripci�n podemos tambi�n deducir la noci�n fundamental de la importancia del surgimiento de las t�cnicas de ADN recombinante.

SEPARACI�N Y AN�LISIS DE LAS PROTE�NAS

Imaginemos a los cient�ficos alemanes Haus y Edward Buchner, quienes en 1897 investigaban las propiedades del proceso fermentativo, usando preparaciones derivadas de levaduras. A partir de un extracto de estos cultivos pod�an observar transformaciones sorprendentes, sin que hubiera ya c�lulas vivas. Se agregaba az�car y, al cabo del tiempo, se notaba la aparici�n de alcohol. �C�mo podr�an ellos identificar los componentes responsables de la reacci�n en la compleja muestra que ten�an? En su �poca, los hermanos Buchner s�lo contaban con pocas posibilidades, sin embargo, pudieron determinar que la reacci�n qu�mica que convert�a el az�car en alcohol depend�a de dos "factores" presentes en el extracto. Uno de ellos se inactivaba al hervir la muestra, y otro, al dializarla (separar sus componentes por tama�o molecular de un lado u otro de una membrana). Conforme el fen�meno era estudiado, nuevas hip�tesis se formulaban, y nuevos m�todos se iban dise�ando para contestar las preguntas formuladas. Tuvieron que pasar muchas d�cadas antes de que fuera claro lo que estaba ocurriendo, una vez que se acumularon conocimientos y nuevas metodolog�as. Estos experimentos iniciales, sin embargo, iban se�alando el camino y paviment�ndolo para el avance futuro.

Actualmente, en cambio, existen muy diversos y complejos m�todos para separar y caracterizar biomol�culas. Los m�todos modernos se basan en alguna propiedad molecular que, al interaccionar con el dispositivo experimental da origen a la separaci�n. Ya mencionamos que el tama�o molecular se puede utilizar para realizar esta acci�n. En la actualidad disponemos de t�cnicas como la cromatografia de exclusi�n, la centr�fugaci�n y la electroforesis (v�ase el recuadro I.3) para la separaci�n por tama�os. Afortunadamente, las prote�nas son mol�culas con tama�os muy variables y bien definidos. Una electroforesis del extracto de levadura mencionado revelar�a un patr�n de m�ltiples componentes, en el que se pueden ir identificando prote�nas individuales.

RECUADRO I.3. Las t�cnicas de separaci�n de las biomol�culas   Hay diversas t�cnicas que se utilizan rutinariamente en el ADN recombinante. Una de las m�s frecuentes es la electroforesis (figura RI.3A). Esta t�cnica se aplica para el an�lisis de ADN y de prote�nas y nos permite, en una de sus versiones, separar estas mol�culas de acuerdo con su tama�o. El principio de la t�cnica es muy simple: si sometemos una mol�cula con carga electrost�tica (afortunadamente tanto el ADN como las prote�nas tienen esta caracter�stica) a la acci�n de un campo el�ctrico, las mol�culas tender�n a moverse: las de carga negativa hacia el electrodo positivo y las de carga positiva hacia el electrodo negativo. La velocidad a la que se mueven depender� de la carga que tengan y del tama�o que sean. Adem�s, se puede mejorar la separaci�n poniendo obst�culos en su camino (un enrejado de mol�culas filamentosas, por ejemplo). Aqu�, las mol�culas m�s peque�as se podr�n mover m�s �gil y r�pidamente que las grandes. Al detener el proceso de electroforesis se obtiene un patr�n o acomodo de bandas, cuya distancia del punto de inicio de la corrida corresponda a su tama�o molecular. En la actualidad se utilizan varios pol�meros que forman tales enrejados o mallas, y adem�s impiden la difusi�n o p�rdida de resoluci�n de la separaci�n. Estos pol�meros forman geles, especie de gelatinas que permiten mantener un registro estable de las mol�culas que se mueven dentro de ellos. De manera an�loga, en la cromatograf�a de exclusi�n (figura RI.3B) se puede colocar en una columna una suspensi�n o pasta de part�culas con agujeros microsc�picos y hacer fluir una soluci�n con las mol�culas a separar por esta columna. Las mol�culas m�s peque�as se ir�n introduciendo en los orificios, lo cual retarda su movimiento. Las mol�culas grandes, que no caben en todos los agujeros, se retardar�n menos. Si vamos colectando el fluido al final de la columna, ir�n apareciendo las mol�culas separadas: primero las m�s grandes y al final las m�s peque�as. Otro principio de gran importancia en los procesos de separaci�n es explotar la diferente afinidad de unas mol�culas por otras. El procedimiento consiste en fijar un material que se une fuertemente a una prote�na a un soporte s�lido (por ejemplo, algo que se parezca a su sustrato). Estas mol�culas que se unen a prote�nas, espec�ficamente, se denominan ligandos. Al hacer pasar una soluci�n con una mezcla de prote�nas por una columna que contenga este soporte, la prote�na que es de nuestro inter�s se quedar� adherida, mientras que las otras pasan de largo. S� despu�s agregamos una soluci�n con abundante ligando libre, la prote�na se despega de la columna, pues ahora el sitio de uni�n lo ocupa el ligando que no est� sujeto, y ya pura, se puede recuperar. Este proceso se denomina cromatograf�a de afinidad (figura RI.3c).

Otra importante propiedad que ayuda a la separaci�n de las prote�nas es su actividad. Cada prote�na tiene una actividad particular que, en muchos casos, se puede medir. Si imaginamos que sometemos una muestra de saliva a un proceso de separaci�n por tama�o molecular; y colectamos 100 fracciones en el proceso, �c�mo sabemos en qu� fracci�n est� la actividad, por ejemplo, que degrada los az�cares? Si contamos con un m�todo f�cilmente visualizable, por ejemplo, una reacci�n qu�mica que origine un compuesto colorido, podemos ensayar esta reacci�n en cada uno de los tubos, y as� conocer�amos el tama�o del componente activo de la saliva, y lo tendr�amos parcialmente purificado.

De maneras similares a las descritas, se fueron identificando muchos de los componentes que constituyen a los seres vivos, y se les fueron asignando actividades. En los a�os setenta ya se dispon�a de la secuencia de amino�cidos de prote�nas y de una descripci�n muy fina de su estructura, incluso en el nivel de resoluci�n at�mica (v�ase el cap�tulo VI).

Separaci�n y an�lisis de los �cidos nucleicos

Como ya se mencion�, los �cidos nucleicos tienen apariencia de largas hebras de unidades b�sicas. Aunque, en principio, las t�cnicas de separaci�n usadas para las prote�nas tambi�n son aplicables para los �cidos nucleicos, aqu� nos encontramos ante un problema: los genes no son entidades moleculares aisladas, con propiedades fisicas o qu�micas que los diferencien. As�, hasta la mitad de los a�os setenta, la estructura de los genes se hab�a inferido s�lo de manera general. Por medio de t�cnicas gen�ticas y de s�ntesis in vitro de pol�meros de nucleotidos, se hab�a podido definir el fundamento del almacenamiento, transmisi�n y expresi�n de la informaci�n gen�tica; �pero no se hab�a podido aislar o purificar; ni se conoc�a la secuencia de ning�n gene en particular. Las t�cnicas de separaci�n ten�an una utilidad muy marginal, en tanto no se dispusiera de un ADN de tama�o manejable y naturaleza uniforme. El avance de este campo de la ciencia depend�a cr�ticamente de poder darle la vuelta a este problema. La sensaci�n era, sin embargo, de desesperaci�n al no ver una posible salida. Parec�a no haber modo de tener acceso al genoma. La comunidad cient�fica se encontraba sujeta al suplicio de T�ntalo: sab�a lo que buscaba y sab�a que era extremadamente importante, pero no pod�a alcanzarlo.