II. LAS LLAVES DE LA BIBLIOTECA DE LA VIDA: LA NUEVA HERRAMIENTA DE LA INGENIER�A GEN�TICA

La nueva herramienta: posibilidad de aislar, caracterizar y manipular los genes

LA INFORMACI�N ya mostrada en los recuadros I.1 y I.2 sobre la estructura y funci�n b�sica de los genes se conoc�a desde finales de los a�os sesenta. M�s a�n, la labor de los bioqu�micos hab�a producido un gran c�mulo de conocimientos respecto de los conjuntos de reacciones qu�micas que ocurren dentro de los seres vivos. Las v�as metab�licas fundamentales para la generaci�n de energ�a y la bios�ntesis de la mayor�a de los compuestos esenciales para la vida ya estaban establecidos.

Este conocimiento se basaba en la aplicaci�n inteligente de m�todos de ensayo y purificaci�n de enzimas clave, y de la identificaci�n y an�lisis de sus sustratos y productos. Al mismo tiempo, otras disciplinas como la inmunolog�a y la gen�tica, realizaban avances y eran actividades de gran complejidad y finura.

La biolog�a molecular, sin embargo, se encontraba en un punto en el que su desarrollo se hab�a hecho muy lento. Una vez sentadas las bases fundamentales de la replicaci�n y expresi�n de la informaci�n gen�tica, el siguiente paso era desentra�ar; en forma detallada, los mecanismos de regulaci�n de la expresi�n gen�tica.

Todas las v�as metab�licas, la expresi�n de anticuerpos, la actividad de los virus, en fin, todas las manifestaciones del fen�meno viviente, est�n, en �ltima instancia, orquestados por la expresi�n ordenada y regulada de los genes, por medio de la producci�n de prote�nas espec�ficas.

El extraordinario proceso por el cual una sola c�lula, el huevo fecundado, da origen a un organismo complejo, es decir; las etapas de diferenciaci�n celular; constitu�a un reto extremadamente atractivo, pero a la vez formidable. No se esperaba poder descifrarlo a un paso siquiera aceptable sin la capacidad de hacer una disecci�n del genoma, de irlo analizando pieza por pieza.

Un descubrimiento clave inici� el cambio dram�tico que conocemos hoy como ingenier�a gen�tica o ADN recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel Nathans descubren una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias espec�ficas, que les vali� el Premio Nobel de fisiolog�a o medicina, compartido con Werner Arber, en 1978.

Este descubrimiento (consecuencia de un hallazgo accidental, en el que los investigadores profundizaron con gran sentido) dio origen a una sucesi�n de nuevos descubrimientos y potenci� el desarrollo de toda una serie de otras disciplinas y metodolog�as. En este cap�tulo revisaremos los fundamentos de algunas de las m�s importantes.

ENZIMAS DE RESTRICCI�N

Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el ADN. Estos sistemas, llamados de modificaci�n-restricci�n, son an�logos a un sistema inmune, los cuales probablemente evolucionaron como un mecanismo de protecci�n de los microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacteri�fagos, que inyectan su propio ADN en la c�lula bacteriana para despu�s controlar su maquinaria celular y redirigirla hacia la s�ntesis de sus propios componentes, dando como resultado final la ruptura de la c�lula y la liberaci�n de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias el ADN propio est� modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificaci�n se desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un peque�o grupo qu�mico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de restricci�n, tambi�n se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta el ADN en esa posici�n. La enzima, sin embargo, no corta el ADN modificado, por lo que efectivamente es capaz de degradar el ADN extra�o que puede entrar a la c�lula, sin alterar el ADN propio.

Hoy en d�a conocemos miles de diferentes enzimas de restricci�n, provenientes de otros tantos distintos microorganismos. M�s de cien distintas secuencias peque�as de ADN pueden ser rotas, espec�ficamente, por medio del uso de la adecuada enzima de restricci�n.

Otra interesante propiedad de las enzimas de restricci�n es que, en general, reconocen secuencias palindr�micas, es decir; secuencias que son iguales si se leen en una direcci�n, o en la direcci�n contraria. Por ejemplo:

— 5�GAATTC3�—

— 3�CTTAAG5�—

es una secuencia palindr�mica. Cuando act�a la enzima que reconoce y corta esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se proyectan fuera de la doble cadena:

— 5�G                 AATTC3�—

— 3�CTTAA                G5�—

Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima.

Los descubridores de las primeras enzimas de restricci�n pronto se dieron cuenta de que su acci�n sobre el ADN (com�nmente llamada "digesti�n") produc�a un conjunto definido de diferentes segmentos. Esto es particularmente f�cil de detectar si la digesti�n se efect�a sobre una mol�cula peque�a; y tales mol�culas existen en la naturaleza. Por ejemplo, ciertos virus est�n constituidos por genomas muy peque�os. El virus SV4O (que ocasiona c�ncer en los simios) contiene una mol�cula de ADN circular de unos 5 mil pares de bases. Muchas bacterias portan peque�as mol�culas de ADN, llamadas pl�smidos, que llevan informaci�n accesoria a su cromosoma. Estas mol�culas pueden tener tambi�n s�lo unos miles de nucle�tidos. Si se somete el producto de digesti�n de una de estas mol�culas a una separaci�n por electroforesis, despu�s de utilizar la enzima de restricci�n, se observa un patr�n de bandas, que corresponde a los fragmentos de ADN de tama�os correspondientes a la distancia entre un sitio y otro. El principio del proceso es an�logo a la separaci�n de prote�nas (v�ase el recuadro II.1).

S�bitamente, el ADN dej� de ser una sustancia mon�tona y fr�gil, donde purificar un segmento espec�fico resultaba una tarea ardua o imposible. Al poder generar segmentos espec�ficos, con las enzimas de restricci�n, la mol�cula de la vida qued� a merced del bi�logo molecular. Es como si alguien jalara la cinta de un casete de audio, la amontonara desordenadamente y luego nos pidiera que separ�ramos el segmento que contiene una canci�n. Ser�a �til disponer de unas tijeras que cortaran la cinta cada vez que apareciera la sucesi�n de notas si, la, sol, do, re, mi, y despu�s un ayudante acomodara los segmentos resultantes, de acuerdo con su tama�o. O imaginemos lo dificil que seria identificar un art�culo de la enciclopedia, si est� escrito sobre un list�n de varios kil�metros de largo. C�mo se facilitar�a la tarea si nuestras tijeras encontraran autom�ticamente, por ejemplo, la palabra "obtener", y ah� cortaran el list�n. Luego nuestro ayudante nos presentar�a 20 ó 30 cajas, cada una conteniendo pedazos de list�n clasificados de acuerdo con su tama�o.

RECUADRO II. 1. La separaci�n de los �cidos nucleicos

 

Cuando se utiliza la electroforesis, es posible visualizar la acci�n de las enzimas de restricci�n. Si se colocan muestras que contienen ADN de diversos tama�os en los pozos de un gel en forma de placa, y se aplica corriente el�ctrica, la diferencia de velocidad de migraci�n de estas mol�culas las distribuir�, por separado, al cabo de un tiempo, dentro del gel. Si despu�s se agrega una sustancia que se hace luminosa al interaccionar con el ADN y ba�arse con luz ultravioleta, directamente se puede observar el patr�n de distribuci�n de las bandas constituidas por las mol�culas de diversos tama�os, por medio del cual es factible deducir sus respectivas dimensiones.

Al usar diferentes enzimas de restricci�n, se generan diferentes segmentos. Por ejemplo, si la secuencia reconocida por la enzima Sall aparece en la mol�cula del ejemplo una vez, cortar�a el segmento en dos partes. Si la secuencia reconocida por EcoRI, aparece dos veces, generar�a tres pedazos. Al usar las dos enzimas simult�neamente, se producir�an cuatro segmentos.



CONCEPTO DE CLONACI�N MOLECULAR

Como ya mencionamos, los fragmentos generados por las enzimas de restricci�n tienen adem�s la propiedad de reasociarse unos con otros, por medio de sus extremos cohesivos. Cuando los investigadores de la gen�tica bacteriana conocieron estas enzimas de reciente caracterizaci�n, a principios de los a�os setenta, se dieron cuenta de algo sumamente importante: si se reasocia un segmento de restricci�n proveniente de un organismo con otro segmento, generado por la misma enzima pero proveniente de otro organismo, se obtendr�a una mol�cula h�brida o quim�rica, una mol�cula de ADN recombinante. De hecho, dado que el ADN de todos los organismos vivientes tiene una naturaleza qu�mica id�ntica, no deber�an existir limitaciones para recombinar el ADN de cualquier origen. Algunos investigadores intuyeron el monumental potencial de este concepto. Los laboratorios de Paul Berg, Stanley Cohen (en la Universidad de Stanford) y de Herbert Boyer (en la Universidad de California, San Francisco) se dieron as� a la tarea de hacer que este concepto se convirtiera en realidad.

Para reasociar dos mol�culas de ADN es necesario reconstituir el enlace fosfodi�ster (un enlace covalente, fuerte), y aqu� entra en acci�n otra enzima que hab�a ya sido descrita para entonces: la ADN ligasa. De esta forma pod�an tomarse las dos mol�culas, reasociarlas (hibridizarlas) y luego ligarlas, se obtiene una mol�cula continua, recombinante, la cual, sin embargo, es algo inerte en tanto no sea introducida a una c�lula que la transcriba y traduzca (v�ase el recuadro I.2). Adem�s, algo muy importante: esta mol�cula debe ser capaz de perpetuarse (replicarse dentro de la c�lula). De otra manera se diluir�a y perder�a irremisiblemente despu�s de que la c�lula se dividiera. Finalmente, era necesario identificar las c�lulas en las que el ADN recombinante se hubiera introducido y establecido.

As� tenemos los elementos esenciales de la t�cnica de ADN recombinante (v�ase el recuadro II.2):

El primer experimento en el que se puso en pr�ctica este concepto, realmente simple, que se conoce como clonaci�n molecular se logr� al utilizar pl�smidos bacterianos como veh�culos y ADN, tambi�n bacteriano, como pasajero.

RECUADRO II. 2. Los procedimientos b�sicos del ADN recombinante

El producto de la digesti�n del ADN con endonucleasas de restricci�n est� constituido por muchos fragmentos espec�ficos, cuyos extremos son compatibles o cohesivos unos con otros. Estos fragmentos se ligan despu�s a un segmento especial de ADN, el veh�culo de donaci�n (usualmente un pl�smido), que fue cortado con la misma enzima. Las mol�culas recombinantes resultantes contienen un ADN veh�culo o vector y un ADN pasajero, constituyendo una nueva mol�cula circular continua.

Estas mol�culas se introducen a c�lulas bacterianas y se seleccionan por medio de "genes marcadores" presentes en el veh�culo de donaci�n. Dentro de su secuencia de ADN los veh�culos de donaci�n contienen se�ales que inducen la replicaci�n del ADN, y otras que producen, t�picamente, resistencia a alg�n antibi�tico. As�, las c�lulas que reciben una mol�cula recombinante la perpet�an en su interior, y se pueden detectar porque �sta confiere a la c�lula la capacidad de sobrevivir en presencia del antibi�tico.





Uno de los primeros veh�culos moleculares de donaci�n, el pl�smido denominado pBR322, fue construido por el doctor Francisco Bol�var, investigador mexicano que se encontraba trabajando en su postdoctorado, a mitad de los a�os setenta, en la Universidad de California, San Francisco. Este pl�smido se ha usado innumerables veces y servido de base para la construcci�n de la mayor�a de los veh�culos m�s modernos de donaci�n. Por la participaci�n del doctor Bol�var en estas investigaciones, aunado a sus otras aportaciones a la ciencia mexicana e internacional, fue galardonado con el premio internacional Pr�ncipe de Asturias en el �rea cient�fica, en 1992, que otorga el gobierno espa�ol.

Consideremos ahora las consecuencias de un experimento de donaci�n molecular. Los segmentos de ADN que se encontraban dispersos en largas y mon�tonas hebras de ADN, resultan ahora disociados en segmentos espec�ficos, y cada uno puede ser perpetuado independientemente. Disponemos ahora de una biblioteca gen�mica o genoteca, que podemos mantener indefinidamente con s�lo mantener vivas las c�lulas bacterianas que albergan los pl�smidos recombinantes. Igualmente, una vez seleccionada una clona de la genoteca, pudimos cultivar las c�lulas y obtener cantidades ilimitadas de ADN para su posterior manipulaci�n y caracterizaci�n. La elusiva purificaci�n de genes espec�ficos se vuelve una realidad.

Como ya se mencion�, las repercusiones de estos primeros experimentos fueron visualizadas r�pidamente, pues inclu�an tambi�n posibles riesgos y problemas, lo cual dio origen a un importante debate, iniciado por la propia comunidad cient�fica (v�ase el recuadro II.3).

RECUADRO II.3. El debate inicial sobre el ADN recombinante

Una de las formas m�s interesantes de comunicaci�n dentro de la comunidad cient�fica internacional es la que ocurre informalmente, por medio de llamadas telef�nicas, visitas, seminarios, etc. Por este conducto existen redes de cient�ficos que est�n bastante bien enterados de lo que se est� desarrollando en otros laboratorios de las �reas competidoras o afines a la propia. As� se supo que se llevar�an a cabo experimentos que pretend�an crear una mol�cula de ADN quim�rica, lo cual un�a material gen�tico de un virus, causante de c�ncer, con el de una bacteria natural del colon humano (Escherichia coli), antes incluso de que se realizaran. Estos experimentos fueron diferidos, pues la preocupaci�n de algunos miembros de la comunidad puso en marcha una serie de conversaciones y correspondencia que llamaba la atenci�n sobre los posibles riesgos de seguir adelante con este tipo de pr�ctica. Fue as� como un grupo de cient�ficos decidi� organizar un comit� que evaluara las posibles consecuencias y riesgos que significaban este tipo de experimentos, durante una reuni�n cient�fica celebrada en junio de 1973. Para abril de 1974, el comit� presidido por Paul Berg (ve�se en este cap�tulo "Concepto de clonaci�n molecular", ) lleg� a la conclusi�n de que era necesario establecer una moratoria que suspendiera la actividad de recombinaci�n in vitro de ADN hasta que se publicaran reglas precisas. En febrero de 1975 se realiz� la c�lebre conferencia de Asilomar, en California, de la que emanaron restricciones importantes acerca de las precauciones que deber�an tomarse para efectuar diversos tipos de experimentos relacionados con el ADN recombinante.

Los hechos antes relatados son notables por dos aspectos. En primer lugar, los cient�ficos de ese campo decidieron suspender temporalmente y reglamentar la ejecuci�n de experimentos que revest�an enorme inter�s para ellos y para el avance del conocimiento. En segundo lugar, las cartas emitidas y las recomendaciones muestran una gran capacidad prospectiva. Se ponderaron los riesgos, consignando claramente que �stos eran de car�cter especulativo, por lo que se dise�aron mecanismos de confinamiento, tanto biol�gico como f�sico, para reducir los riesgos al m�nimo.

El debate acerca del ADN recombinante contin�a desde entonces. Hay grupos que han mantenido una oposici�n constante; las acciones de los gobiernos incluyen la creaci�n de reglas detalladas y estrictas. El tiempo, sin embargo, ha probado ya que el balance entre los riesgos y los beneficios de la experimentaci�n en ingenier�a gen�tica es abrumadoramente positivo. De hecho, ninguno de los desastres previstos ha tenido siquiera visos de convertirse en realidad. Aparentemente, la probabilidad de crear por accidente un organismo vivo peligroso es muy baja: los organismos ocupan nichos a los que se han adaptado durante millones de a�os y compiten muy favorablemente con variantes creadas en el laboratorio.

Si el temor de crear organismos monstruosos causantes de epidemias incontrolables o de diseminar enfermedades parece haber sido infundado. Lo que s� ha surgido es toda una serie de problemas �ticos, resultado del poder�o que confiere al g�nero humano esta metodolog�a. Como suele pasar, no es el accidente, sino la deliberada acci�n de los individuos lo que conduce a las mayores preocupaciones y trastornos en la sociedad. (En el Ep�logo de este libro se hace una reflexi�n m�s detallada acerca de este tema).

Durante la d�cada siguiente, en un proceso continuo y creciente de desarrollo metodol�gico, se constituy� un verdadero arsenal de diferentes herramientas biol�gicas que aumentaron notablemente la capacidad de aislar; caracterizar y manipular los genes. (La descripci�n de algunas de las t�cnicas b�sicas m�s importantes se destaca en lo que resta del cap�tulo. En el cap�tulo siguiente se ven ejemplos de su aplicaci�n y se describen otras t�cnicas importantes)

EL ADN SINT�TICO

Desde la �poca de los experimentos pioneros en que se defini� el c�digo gen�tico fue necesario elaborar mol�culas de �cidos nucleicos no naturales. Se inici� entonces el desarrollo de las t�cnicas para sintetizar o fabricar qu�micamente el ADN. El desenvolvimiento de la qu�mica org�nica, que precedi� al de la biolog�a molecular; hab�a establecido desde tiempo atr�s la naturaleza qu�mica de los �cidos nucleicos. Se requiri�, sin embargo, un periodo relativamente largo para perfeccionar adecuadamente las t�cnicas para sintetizar el ADN de manera pr�ctica. Desde fines de los a�os sesenta, Har Cobind Khorana logr� la tarea tit�nica de elaborar qu�micamente un peque�o gene a partir de sus precursores b�sicos (los nucle�tidos A, G, C y T). Este trabajo hizo al doctor Khorana merecedor del Premio Nobel de fisiolog�a o medicina en 1968. Los siguientes quince a�os fueron necesarios para que una t�cnica laboriosa, que requer�a la participaci�n de qu�micos especializados, se convirtiera en una tarea simple y automatizada, al alcance de cientos de laboratorios del mundo. Actualmente, mediante s�ntesis qu�mica se obtienen miles de fragmentos de ADN cada d�a. El factor clave para la simplificaci�n del procedimiento consisti� en lograr la s�ntesis en fase s�lida, que es susceptible de ser adaptada a una m�quina autom�tica (v�ase el recuadro II.4). Las limitaciones de esta t�cnica s�lo permiten sintetizar directamente fragmentos de ADN de un tama�o menor a unas 100 bases, por lo que normalmente se les conoce como oligonucle�tidos (o simplemente oligos). De cualquier manera, utilizando las propiedades de hibridaci�n del ADN y de la enzima ADN ligasa, se pueden construir grandes trechos de ADN de doble cadena.

Al disponer de oligos, cuya secuencia está definida por el investigador, se abren posibilidades para crear genes con completa libertad, y tambi�n para modificar, en principio sin limitaci�n alguna, a los genes naturales (v�ase el recuadro II.4). (En secciones sucesivas se ver�n algunas mas de las m�ltiples aplicaciones de los oligos sintéticos.)

RECUADRO II.4. El ADN sint�tico y sus aplicaciones

Para un qu�mico, la tarea de sintetizar mol�culas de ADN representa varios retos. El objetivo es ensamblar secuencias definidas, a partir de los cuatro nucle�tidos A, G, C y T. Muchos a�os de trabajo, de varios laboratorios, han culminado en los sintetizadores rob�ticos que se usan hoy en d�a, y con los que se producen miles de oligos para las m�s diversas aplicaciones.

Una vez resuelto el problema de enmascarar selectivamente los grupos qu�micos presentes en los nucle�tidos, se pueden hacer reaccionar ordenadamente, para ir produciendo la secuencia. En la actualidad se utiliza el m�todo en fase s�lida, en el que la cadena de ADN va creciendo adherida a peque�as part�culas de vidrio. En la s�ntesis automatizada, una m�quina, constituida por v�lvulas y botellas controladas por una computadora, va inyectando diversas soluciones al reactor que contiene el vidrio. C�clicamente se activa el oligo, se le hace reaccionar con la base siguiente y se lava.

Con esta t�cnica se puede llegar; pr�cticamente, a oligos de hasta 50 ó 100 nucle�tidos de longitud.

Entre las aplicaciones m�s frecuentes y �tiles de oligos sintéticos se encuentra la construcci�n de genes, que se logra hibridizando oligos complementarios los cuales reconstruyen el ADN d�plex con la secuencia dise�ada. Otro enfoque de gran utilidad se denomina mutag�nesis dirigida. En este caso, el oligo se usa para alterar espec�ficamente una peque�a regi�n dentro de un gene natural clonado.







ENZIMAS �TILES PARA MANIPULAR EL ADN

Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante enzima que permite ligar o unir mol�culas de ADN. La investigaci�n sobre la fisiolog�a de los �cidos nucleicos ha proporcionado, adem�s, una serie de enzimas que se utilizan ampliamente para manipular los �cidos nucleicos en el tubo de ensayo, y que forman parte importante de las herramientas del ADN recombinante. Cada una de estas enzimas, al igual que las endonucleasas de restricci�n, cumple un papel dentro de la c�lula viva, para alterar el material gen�tico (por ejemplo, para repararlo, replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). En el laboratorio se pueden usar estas enzimas, despu�s de purificarlas de sus fuentes naturales, para efectuar transformaciones �tiles a los prop�sitos del experimentador. Por ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos virus para invadir el genoma de sus c�lulas blanco (v�ase el recuadro IV.3), se utiliza ampliamente para clonar genes a partir de sus ARN mensajeros (v�ase el capitulo siguiente).

Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante, ha potenciado, a su vez el desarrollo de herramientas moleculares, hoy en d�a contamos con un enorme n�mero de enzimas y reactivos que permiten gran versatilidad en la manipulacion del ADN.

SECUENCIACI�N DEL ADN

Una consecuencia inmediata de la clonacion molecular es que permite disponer de cantidades ilimitadas de segmentos específicos de ADN. Debido a que el ADN pasajero se encuentra formando parte de un pl�smido, es factible separarlo f�cilmente del resto del ADN celular, que se encuentra en el cromosoma bacteriano, una mol�cula mucho m�s grande. A partir de un cultivo de E. coli, se puede separar suficiente ADN plasm�dico para caracterizarlo. Una vez que se dispuso de genes individuales purificados, el escenario estaba listo para la siguiente etapa.

Walter Gilbert, en la Universidad de Harvard, y Frederic Sanger, en Cambridge, Inglaterra, se dieron a la tarea de desarrollar t�cnicas para determinar la m�s importante caracter�stica del ADN, su secuencia de bases. Pocos a�os despu�s lograron su objetivo, y compartieron el Premio Nobel de qu�mica en 1980. Las t�cnicas de secuenciaci�n actuales (v�ase el recuadro II.5) son usadas abundantemente e, inclusive, han sido automatizadas. A la fecha, genes de las m�s diversas fuentes han sido secuenciados, acumulando una base de datos que representa cientos de millones de nucle�tidos. Esta cantidad crece a paso inexorable y se espera que lo haga cada vez m�s aceleradamente (v�ase la secci�n sobre la secuenciaci�n del genoma humano, en el cap�tulo IV).

RECUADRO II. 5. Procedimiento para obtener la secuencia del ADN

A partir de un gene donado se pueden seguir hoy en d�a diversos procedimientos para deducir su secuencia nucleot�dica. Hasta ahora se han empleado casi exclusivamente, los m�todos de Maxam-Gilbert y el de Sanger; los cuales tienen en com�n generar una colecci�n de fragmentos con un extremo com�n, y el otro termina en una de las cuatro bases. En el m�todo de Maxam-Gilbert se utilizan reacciones qu�micas espec�ficas para lograr este objetivo. En el m�todo de Sanger se emplean reacciones enzim�ticas.

En la figura se ilustra el m�todo enzim�tico. A partir de un oligo marcado se inicia una reacci�n de replicaci�n in vitro. Esta reacci�n procede hasta encontrar un nucle�tido terminador, que no permite que la cadena replicada siga creciendo. Se efect�an cuatro reacciones, una para cada base de ADN que contiene el nucle�tido terminador correspondiente, y se termina con cuatro colecciones de fragmentos marcados, cada una constituida por fragmentos que terminan en A, G, C o T, respectivamente.

El an�lisis del tama�o de estos fragmentos, mediante electroforesis en gel, revela de inmediato un patr�n de bandas, que corresponde directamente a la secuencia que se encuentra enfrente del oligo iniciador.

En el cap�tulo IV, "Nuevas t�cnicas de secuenciaci�n" p. 101, se relatan nuevos m�todos que prometen revolucionar la t�cnica de secuenciaci�n del ADN.





LA REACCI�N EN CADENA DE POLIMERASA

Otro de los avances metodol�gicos m�s importantes es la reacci�n en cadena de polimerasa (PCR, siglas en ingles polymerase chain reaction). Este procedimiento constituye un ejemplo sumamente interesante de la importancia de la metodolog�a en el desarrollo cient�fico. Tambi�n ilustra la manera como ocurren muchos de los descubrimientos: a partir de intuiciones que integran conocimientos que han estado disponibles durante cierto tiempo.

En efecto hacia 1985 —con el ADN recombinante ya plenamente establecido como una t�cnica aplicada rutinariamente por cientos de laboratorios en el mundo—, Kary Mullis, quien a la saz�n trabajaba para la compa��a Cetus, en San Francisco, California, tuvo una s�bita inspiraci�n mientras manejaba su auto y se dirig�a hacia una caba�a en la que se dispon�a descansar el fin de semana. Como muchos otros investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones para los oligos sint�ticos. Concibi� entonces la idea de que combinando el uso de los oligos con varios ciclos de replicaci�n in vitro se pod�a amplificar, es decir; obtener en gran cantidad, un segmento de ADN espec�fico (por ejemplo, un gene en particular).

Pero veamos con m�s calma en qu� consiste la idea (figura II.1). La enzima ADN polimerasa participa en la replicaci�n del ADN (recuadro I.I). Para convertir una mol�cula de ADN de doble cadena en dos mol�culas id�nticas, la enzima requiere que las cadenas de la mol�cula inicial se separen, para as� tener un molde disponible. Adem�s, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre, que sirve para cebar o iniciar la reacci�n de replicaci�n y los nucle�tidos precursores. Si se colocan estos sustratos en un tubo de ensayo, la ADN polimerasa puede incorporar uno por uno los nucle�tidos correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar� T en la cadena creciente; frente a G, C, etc. En realidad, �ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde mucho antes de que se concibiera la t�cnica de la PCR. Lo original de la idea de la concepci�n de Mullis fue pensar qu� suceder�a si se aplica este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reacci�n en cadena. Los oligos sint�ticos, en virtud de su propiedad de hibridaci�n de los �cidos nucleicos, definen los puntos de partida para el copiado de las cadenas de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia define los extremos de un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del molde, previamente separadas, y se someten a una reacci�n con ADN polimerasa, de lo que resultar�n dos mol�culas cuyos extremos est�n definidos por los oligos y que corren en sentido opuesto. Las cadenas resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de mol�culas con la secuencia que demarcan los oligos. �Qu� pasa si ese proceso se repite, c�clicamente? �El resultado es lo que se denomina un crecimiento exponencial! En el siguiente ciclo de separaci�n de cadenas, hibridaci�n con los oligos y reacci�n con ADN polimerasa, se obtendr�n cuatro mol�culas de la regi�n entre los oligos. Los ciclos subsiguientes generar�n 8, 16, 32, 64 mol�culas, y as� sucesivamente. Para comprender mejor las implicaciones de un proceso exponencial, recordemos la f�bula del inventor del ajedrez. Se cuenta que un rey qued� tan asombrado de lo interesante que resultaba el juego, que ofreci� recompensar al s�bdito que se lo ense��. Este le pidi� "solamente" un grano de trigo por el primer cuadro del tablero, dos por el segundo, cuatro por el tercero, y as� sucesivamente. El rey, sin hacer c�lculos, accedi� de buen grado. Por desgracia para el rey, todas las cosechas de trigo del mundo fueron insuficientes para completar la solicitud del inteligente vasallo. S�lo por el cuadro 30 se requer�an 1 073 741 824 granos de trigo.





As�, con la t�cnica de la PCR se pueden amplificar segmentos espec�ficos de ADN para crear muchos millones de mol�culas a partir de unas cuantas, o incluso de una sola. Para esto se requiri� adaptar el concepto b�sico haciendo uso de ADN polimerasas provenientes de microorganismos term�filos (que crecen a temperaturas de m�s de 70 grados en manantiales termales). De otra manera, la enzima se inactivaba cada ciclo, pues se requiere aplicar calor para separar las mol�culas del ADN molde. Hoy d�a un ciclo puede tomar cinco minutos o menos, por lo que el proceso de amplificaci�n se lleva a cabo en menos de dos horas (normalmente 20 ó 30 ciclos son suficientes).

Nuevamente nos encontramos ante un concepto bellamente simple. Lo sorprendente es que los elementos t�cnicos y conceptuales necesarios para esta invenci�n estuvieron disponibles por varios a�os antes de que Kary Mullis los desarrollara.

La aplicaci�n de la PCR, en s� misma, constituye un avance revolucionario en la investigaci�n biol�gica moderna. Uno de los m�s espectaculares ejemplos que ilustran la potencia de esta t�cnica es el rescate y secuenciaci�n de ADN prehist�rico (realidad que sustenta la historia de ciencia ficci�n Parque Jur�sico de Michael Crichton). (En cap�tulos siguientes consideraremos otras aplicaciones en las que la PCR desempe�a un papel indispensable.)

OTRAS T�CNICAS IMPORTANTES EN BIOLOG�A EXPERIMENTAL MODERNA

En los cap�tulos que siguen hablaremos de las muchas maneras en que los investigadores aplican m�todos espec�ficos para lograr sus objetivos de aislar, caracterizar y manipular genes y sus productos. Cada problema requiere echar mano de las t�cnicas m�s modernas y avanzadas. Efectivamente, en la pr�ctica, la labor de un cient�fico est� fuertemente condicionada por las t�cnicas experimentales de que dispone y puede manejar.

As�, entre el gran número de t�cnicas que no mencionamos en este capitulo, algunas har�n su aparici�n cuando se describan aplicaciones especificas. Observaremos c�mo se utiliza reiteradamente la propiedad de reconocimiento molecular, de asociarse espec�ficamente tras mol�culas. �Realmente el cient�fico moderno tiene las herramientas para encontrar una aguja en un pajar! Trataremos de resaltar tambi�n c�mo los avances de tecnolog�as que provienen de disciplinas diferentes son incorporadas �vidamente por los bi�logos. Su uso les permite prosperar en las respuestas a las preguntas que se est�n formulando.  

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