No fue circunstancial que los dos primeros obispos de estas tierras fueran franciscanos. Su orden se ocupó de la evangelización en el occidente y, para 1560, ya tenía numerosos conventos por la región, donde los frailes hallaban suficientes moradores para su mantenimiento. Como los indios hablaban varios idiomas y dialectos y la comunicación con ellos y entre ellos se hacía muy difícil, los franciscanos se preocuparon por aprender el náhuatl y terminaron por enseñarlo a todos los naturales, para simplificar su labor evangelizadora. De esta manera, evitaban que tanto el clero secular como los laicos tuviesen intercambio con los indios. Más tarde, al declinar el siglo XVII, con la paulatina incorporación de los aborígenes a la nueva sociedad, el castellano desplazó gradualmente a la lengua nativa.
La Iglesia se hizo también cargo de la educación de los demás habitantes y ejerció un estricto control ideológico sobre ellos. En los inicios se trabajaba con pequeños grupos en sacristías y conventos, pero durante las tres últimas décadas del siglo XVI, el número de posibles educandos en Guadalajara y Zacatecas ameritó que comenzaran a fundarse algunos centros educativos más formales. Para 1570 ya funcionaba en Guadalajara el Colegio Seminario del Señor San Pedro pero su existencia terminó al finalizar 1586 cuando llegaron los Jesuitas y se hicieron cargo de casi todos los estudiantes.
A diferencia de los agustinos, a quienes se pusieron muchas trabas para establecerse en la ciudad, la Compañía de Jesús contó con todas las facilidades, incluso le fue cedida la hacienda de Toluquilla para su sostenimiento. Hacia 1680, problemas económicos debidos a la escasez de mano de obra casi provocan que la Compañía cerrara sus escuelas; sin embargo, la Real Audiencia intervino consiguiendo los brazos indígenas necesarios de donde fuera.
Esta orden religiosa llegó a ofrecer estudios de latinidad, los más elevados de Guadalajara, en el Colegio de Santo Tomás; también instituyeron varias escuelas de primeras letras para niños y se hicieron cargo de la enseñanza y doctrina de muchos indios de la comarca. Además, en 1616, fundaron en Zacatecas el Colegio de San Luis Gonzaga. Por otra parte, hacia 1586, el primer colegio para niñas empezó a funcionar bajo la advocación de Santa Catalina de Siena y el gobierno eclesiástico de Francisco Gómez de Mendiola. En los siglos XVI y XVII, a los niños se les enseñaba a leer y escribir y un poco de gramática. Pero si alguno pretendía cursar grados más altos tenía que trasladarse a la ciudad de México.
Para castigar la herejía, desde los tiempos del obispo Pedro Gómez Maraver, se instaló en Guadalajara la Santa Inquisición, aunque únicamente para procesos de importancia menor, pues los mayores debían seguirse en la ciudad de México. Los casos más frecuentes atendidos por este tribunal fueron la blasfemia, el judaísmo, la hechicería y las palabras malsonantes. También fue común enjuiciar a clérigos por violación al voto de castidad y a laicos por bigamia.
