Los indios que sobrevivieron al primer encuentro y no huyeron de Tabasco se convirtieron en tributarios, y los españoles buscaron acoplarlos a las instituciones de gobierno que se iban creando, como las alcaldías mayores y las regidurías, que no resultaron comprensibles para los indios, quienes pasaron a constituir un grupo subordinado. A pesar de las órdenes de la Corona de disminuir los tributos, los pueblos contribuían con cacao en almendra —grano muy preciado en la cultura prehispánica, y del que Tabasco era el principal productor— un hogar producía en 1541 entre 4 000 y 8 000 almendras, además de maíz, miel, chile, frijol y mantas; todos ellos productos con valor de cambio desde tiempos inmemoriales.
La encomienda fue el medio utilizado por los españoles para subordinar a los diferentes pueblos que, pese a las resistencias, eran articulados mediante esa forma de dominio. Probablemente, como en el resto de la Nueva España, el virrey Antonio de Mendoza envió en 1542 desde la ciudad de México a un alcalde ordinario con funciones de visitador a la provincia de Tabasco para investigar lo concerniente a los tributos y al trato que recibían los indios de encomenderos, corregidores y calpixques. Como un ejemplo de las reacciones posteriores ante los procedimientos de los españoles con autoridad, Francisco de Montejo fue despojado de la alcaldía mayor de Tabasco por una orden real, según cuenta Mario Humberto Ruz.
La conquista y posterior colonización tuvo una justificación religiosa, y con seguridad muchos españoles actuaron convencidos de que ése era el único fin; para los cronistas, se trataba de llevar a los indios la santa fe católica y la doctrina cristiana. Algunos de ellos, por vistas o por intersección de terceros, escribieron sobre los sacrificios humanos y la idolatría. Poco se sabe del panteón de los chontales, y casi nada del de los zoques y nahuas de la región. Los rasgos del panteón mesoamericano, sin embargo, estuvieron presentes en la adoración a Kukulkán-Quetzalcóatl. Ídolos de barro y piedra que nombraban chalchihuites, según los cronistas, eran deidades del sol, del viento, del maíz. Los adoratorios de piedra y los vestigios de sacrificios humanos dieron lugar a toda suerte de fantasías.
Como la luz del cristianismo difícilmente penetraba en las tierras descubiertas, Cortés se propuso, según Francisco Javier Clavijero, "...separar a los nativos de su grosera idolatría y sustituir una forma más pura de culto. Para conseguirlo, estaba dispuesto a usar de la fuerza si las medidas suaves eran ineficaces. Sabía que nada deseaban los soberanos españoles más ardientemente que la conversión de los indios". Según los cronistas, ésas eran las devotas intenciones caballerescas de los conquistadores. Sus creencias los llevarían a emprender una nueva cruzada para sembrar la semilla de la verdadera fe. Para el mismo historiador:
La religión católica, debe confesarse, tiene algunas ventajas decididas sobre la protestante para el fin de hacer prosélitos. La deslumbrante pompa de sus ceremonias, y su patética interpretación a la sensibilidad, afectan la imaginación del rudo hijo de la naturaleza más intensamente que las frías abstracciones del protestantismo, que dirigiéndose sólo a la razón, exigen un grado de refinamiento y cultura mental en el auditorio para comprenderlas.
Asimilar lo nuevo sobre lo viejo fue una de las estrategias puestas en práctica por los conquistadores desde que, asombrados, encontraron que los indios adoraban un emblema en forma de cruz, que simbolizaba al dios de la lluvia. Sobre esa adoración y la mitología del benéfico Quetzalcóatl harían recaer la advocación a la Virgen y al Redentor. Pero la consigna de "a sangre y fuego" prevaleció en los hechos. Luego de la batalla de Centla, Cortés instruyó a Jerónimo de Aguilar para que hablara en contra de la idolatría y de los sacrificios humanos; así, mientras se destruían los ídolos del templo mayor de Potonchán, De Aguilar predicaba las bondades del catolicismo.
En 1527 el obispado de la región, con sede en Yucatán, incluyó a Tabasco, así como la parte que abarca desde el río Grijalva hasta Chiapas; en 1539, al crearse la diócesis de ese lugar, la provincia tabasqueña pasó entonces a formar parte de ella. En los años previos algunos franciscanos pasaron por la región predicando desde Guazacualco y Santa María de la Victoria hasta Xicalango, pero el territorio sería de los dominicos, quienes realizaron una ofensiva evangelizadora. Esto se debió, en parte, a la influencia que fray Bartolomé de las Casas tenía sobre el rey y su Consejo de Indias en España. A su paso como obispo a Ciudad Real en 1545, Las Casas visitó Tabasco y tuvo muy buena impresión, porque ya había rituales católicos entre los indios, la mayoría de los cuales estaba bautizada. Su obispado incluyó además Soconusco, Tezulutlán y Yucatán, extensión que mantuvo hasta 1562.
Las Casas logró neutralizar la influencia de Montejo en la región, pero la evangelización sufrió serios tropiezos por la resistencia que manifestaron los indios durante un largo periodo; superficialmente se definían como católicos, pero en sus prácticas privadas adoraban a las deidades prehispánicas, que mantuvieron ocultas, e incluso algunos de ellos huyeron a resguardarse con sus ídolos en los bosques y en las selvas.
El ordenamiento civil, por su parte, no lograba prosperar, porque Tabasco inicialmente fue ligado a la Nueva España, junto con Yucatán y Cozumel, luego a la Audiencia de los Confines en 1543, y alternadamente perteneció a Guatemala y a México. La Audiencia de la Nueva España asumió finalmente, en 1560, la jurisdicción definitiva sobre Yucatán, Tabasco y Cozumel.
Un hecho importante que ejemplifica la oposición entre el poder civil y el eclesiástico se presentó en 1620, cuando el alcalde mayor propuso el traslado de Santa María de la Victoria. Para ello era necesaria la mudanza de españoles, indios y mulatos de la villa a San Juan, que asumiría el nombre de Santa María de la Victoria la Nueva, para evitar que cayera en el olvido el nombre de la primera ciudad española en Tabasco. Pero el obispo de Yucatán, Gonzalo de Salazar, después de escuchar las inconformidades, decidió inmiscuirse en la esfera de lo civil y desobedecer el mandato del virrey, por lo que el traslado acontecería varios años después. En el cambio de ubicación influyó de manera determinante el asedio constante de los piratas quienes atacaron el lugar en varias ocasiones a partir de 1600, y aunque continuaron sus hostilidades durante muchos años, el devastador ataque del 24 de febrero de 1665, como cuenta Mario Humberto Ruz, fue decisivo para el cambio:
En 1666 se trasladó la capital de la provincia a Tacotalpa de la Real Corona, pueblo indio cuyo florecimiento provocó que los españoles intentaran enseñorearse con él: ya no se conformaban con avecindarse en las comunidades indígenas o cerca de ellas para mejor explotarlas.
El gobernador, los regidores y el común del pueblo apelaron en 1678 a la Audiencia para que invalidase los autos del alcalde mayor, don Diego de Loyola, interesado desde hacía varios años en transformar el pueblo en una villa española, cabecera de los poderes locales, y amparase "en la posesión" de su pueblo obligando al alcalde a mantener los poderes en la villa vieja llamada Villahermosa.
No obstante, el procedimiento fue finalmente detenido por no convenir a los interesados que pretendían conservar sus prebendas, como tierras, iglesia y pueblos sujetos.
En cuanto a los edificios del culto católico no se había avanzado gran cosa, porque eran construidos con materiales efímeros de esa región que el clima y las intensas lluvias destruían con facilidad.
En un territorio como ése pocas acciones podía desarrollar el Santo Oficio, pero lo que pudo hacer lo hizo, y en la mayoría de los casos asumió el papel tanto de vigilante de la preservación de las buenas costumbres como de defensor abierto de la población; así, cuando los frailes no ejercieron la protección de los indios sino que, por el contrario, aprovecharon su situación para instigar a la feligresía a la concupiscencia, fueron perseguidos.
En 1568 se tiene noticia del proceso contra un fraile franciscano por proferir palabras heréticas en sus sermones pronunciados en la villa de Santa María de la Victoria. Por los procedimientos seguidos, este caso parece haberse derivado de las pugnas que tenían lugar en toda la Nueva España entre el clero regular y el secular. Los juicios contra clérigos y frailes continuaron, así como contra autoridades civiles, como alcaldes y miembros de la milicia; contra encomenderos que maltrataban a los indios o contra quienes los incitaban a ingerir bebidas embriagantes.
