IV. CAT�LISIS ENZIM�TICA

LAS reacciones qu�micas que ocurren en los sistemas vivientes son tan variadas como complejas. Sin embargo, la naturaleza provee velocidades de reacci�n en condiciones por dem�s suaves, que har�an avergonzar al mejor qu�mico. La mayor�a de las reacciones que ocurren en los sistemas vivos son catalizadas por prote�nas conocidas con el nombre de enzimas. Cientos de enzimas han sido aisladas y probablemente existen cientos de miles en la naturaleza. Su estructura es muy compleja, y puede ser representada como se muestra en la figura 4.

Las enzimas reciben su nombre en funci�n de su actividad espec�fica, as�, por ejemplo, la enzima "ureasa" cataliza con eficiencia la hidr�lisis de la urea, las proteasas act�an sobre las prote�nas, las amidasas sobre las amidas, etc. Todas las enzimas desde el punto de vista qu�mico son prote�nas, pero pueden asociarse con substancias no prote�nicas, llamadas coenzimas o grupos prost�ticos, que son esenciales para la acci�n de la enzima. A veces las enzimas son inactivas catal�ticamente, si no se encuentran en presencia de ciertos iones met�licos. A la luz de muchos estudios se ha logrado establecer que no toda la mol�cula de prote�na presenta actividad catal�tica, sino �nicamente una regi�n relativamente peque�a, la cual se denomina centro activo. Los mecanismos de reacci�n de las enzimas son muy complejos, implicando un n�mero de etapas elementales cada una de las cuales puede incluir interacciones complejas entre varios grupos de las mol�culas de la enzima y el sustrato. En las reacciones catalizadas por enzimas las velocidades de reacci�n, as� como los mecanismos se ven afectados por cambios en la concentraci�n, el pH y la temperatura.

Figura 4. Estructura cristalina de la carboxipeptidasa A.

En la elucidaci�n de los mecanismos de reacci�n de las enzimas, y principalmente aquellas que involucran un ion-met�lico o metaloenzimas, se requiere conocer: 1) La afinidad de los reactantes, las coenzimas y los cofactores; 2) Las constantes de velocidad para cada paso; 3) Las relaciones geom�tricas tridimensionales entre los reactantes, las coenzimas en relaci�n a los sitios catal�ticamente importantes de la enzima; y 4) el mecanismo de cada paso, es decir los arreglos at�micos y electr�nicos. El mecanismo qu�mico est� determinado por el tipo de rompimiento y formaci�n de enlaces que lleva a cabo la enzima.

Se ha propuesto que las enzimas contienen en sus "centros activos" �cidos (AH) o bases (B) de manera que se puede calcular su fuerza �cida o b�sica. As� la pepsina, enzima que cataliza la hidr�lisis de ciertos enlaces p�pticos en el est�mago, tiene un valor de fuerza �cida (pK) de 2.2. El �nico grupo org�nico que puede dar este valor es el COOH^-. Tambi�n hay enzimas con caracter b�sico como la quimotripsina y la colinesterosa con un pK=7.2.

El hecho de que puedan existir esos dos tipos de grupos �cidos y b�sicos al mismo tiempo es posiblemente la explicaci�n qu�mica del efecto tan selectivo observado en la cat�lisis por enzimas, ya que el ataque simult�neo por las dos especies �cida y b�sica debe traducirse en una mejor�a muy notable de la velocidad y la selectividad, con un mecanismo que podr�a llamarse de "estira y afloja". El equivalente en cat�lisis heterog�nea podr�a ser un mecanismo bifuncional (que comprende dos funciones con dos tipos de sitios diferentes), con la salvedad de que en la enzima los dos activos pueden actuar sobre la misma mol�cula al mismo tiempo y en la heterog�nea esto no es posible.

La complejidad de la estructura de las enzimas se puede comprender al observar la estructura b�sica de la carboxipeptidosa A, que es una mol�cula relativamente simple con un peso molecular de 36 400 (existen enzimas de peso molecular de 600 000), su estructura obtenida por microscop�a electr�nica se muestra en la figura 4.

La enzima es ligeramente elipsoidal de dimensiones 50 X 42 X 38 Angstroms. En esta estructura se pueden ver un enlace azufre-azufre en el extremo derecho, y un �tomo de zinc (Zn²⁺) en el centro, alrededor del cual se sit�a el "sitio activo". El ion Zn²⁺es absolutamente esencial para la actividad enzim�tica de la carboxipeptidosa A. Sin embargo se puede cambiar ese ion por otros iones met�licos como Mn²⁺, Fe²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, etc., cambi�ndose tanto la actividad como la selectividad de la enzima.

Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas son en general proporcionales a la primera potencia de la concentraci�n de la enzima (son de primer orden respecto a la enzima). Sin embargo, es frecuente encontrar una dependencia de la concentraci�n del sustrato (sobre el que act�a la enzima), como se muestra en la figura 5. La velocidad var�a linealmente con la concentraci�n de sustrato a concentraciones bajas (primer orden respecto al sustrato) y se hace independiente de la concentraci�n de �ste (orden cero) a concentraciones elevadas. Este tipo de comportamiento fue explicado por Michaelis y Menten en funci�n del mecanismo siguiente:

1. Interacci�n de la enzima con el substrato (reactivo), para formar un complejo intermediario

11 k1

E1+1S11ES

xxxk-1

2. Descomposici�n del complejo intermediario para dar los productos y regenerar la enzima

 

k2111

E1S E + P

E es la enzima, S el sustrato, ES un complejo y P es el producto. Aplicando el tratamiento cin�tico denominado del estado estacionario, en el que se asume que la concentraci�n del complejo intermediario es constante obtenemos

 

K1[E] S - k_1 [ES] - K2[ES] = 0

I

 

Si la concentraci�n total de la enzima [E]o es igual a la suma de la concentraci�n en enzima libre [E], m�s la concentraci�n de enzima que forma el complejo [ES]:

 

[E]o = [E] + [ES]

II

Introduciendo [E] de la ecuaci�n II en la ecuaci�n I, tenemos:

K1 ([E]_o - [ES]) [S] - (K_₁ + K₂)[ES] = 0

de donde podemos obtener la concentraci�n de enzima que est� formando el complejo

Se asume que la etapa determinante de la reacci�n es la descomposici�n del complejo, entonces la velocidad de la reacci�n es v=k₂[ES] en donde se substituye [ES]

que rearreglando nos da:

III

 

donde km = se denomina constante de Michaelis.

De la ecuaci�n III se deduce que cuando [S] es suficientemente peque�a,

lo que indica primer orden respecto a la concentraci�n de sustrato. Por el contrario, cuando [S] es mucho mayor que K_m^,

v = k₂ [E_o]

y la cin�tica es orden cero respecto al sustrato. En ambos casos el orden es b>1 para la concentraci�n de enzima. La ecuaci�n III da cuenta entonces del comportamiento observado en la figura 5.

Figura 5. Dependencia t�pica de la velocidad de una reacci�n enzim�tica como funci�n del sustrato S.

Muchas reacciones obedecen la ley de Michaelis (ecuaci�n III), sin embargo, el mecanismo queda a�n en la duda ya que a trav�s de otro mecanismo complejo es posible llegar a la misma ecuaci�n cin�tica.

El efecto del cambio de pH en las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas se puede observar en la figura 6. Se tiene un m�ximo y la primera explicaci�n de este hecho fue dada por Michaelis. La idea b�sica es que el centro activo de la enzima puede existir en tres estados de ionizaci�n dependiendo de la fuerza �cida,

zzzKb            ka

EH2 EHE

Las constantes de disociaci�n se representan por kb y ka. Cada una de las tres formas de la enzima puede interaccionar con el sustrato,

zzzKb              ka

EH2 EHSES

Si se postula que s�lo EHS puede dar productos, el esquema de reacci�n queda entonces

EH2      EH       E
EH2S		EHS		ES
			K2
		EH	+ P

As�, en soluci�n �cida, la enzima estar� en la forma EH₂ y formar� con el reactivo el complejo EH₂; este complejo se descompone para dar otro complejo EHS, el cual a su vez se descompone para dar los productos y luego entonces la velocidad ser� peque�a (lado izquierdo de la figura 6). Si la soluci�n es b�sica predominan las formas E y ES y la velocidad ser� tambi�n peque�a. A cierto pH intermedio, llamado pH �ptimo, se observar� la concentraci�n m�xima de EHS y ser� por lo tanto el m�ximo de la velocidad.

Los estudios sobre velocidades de reacciones catalizadas por enzimas a diversos valores de concentraciones y pH han permitido obtener los valores de las constantes de disociaci�n ka, kb, k'a y k'b. Las dos primeras corresponden a informaci�n sobre la naturaleza del centro activo. Por ejemplo, la pepsina, enzima que cataliza la hidr�lisis de ciertos enlaces pept�dicos en el est�mago tiene un pK = 2.2, siendo el �nico grupo org�nico conocido que puede dar este valor el grupo carboxilo (-COOH), concluy�ndose que esta enzima trabaja en condiciones muy �cidas equivalentes a las de un �cido ac�tico (principal constituyente del vinagre).

Figura 6. Variaci�n de la velocidad en funci�n del pH, para una reacci�n enzim�tica.

Los valores de k'a y k'b proporcionan informaci�n respecto de la forma en que los grupos ionizantes del centro activo tienen interacci�n con el sustrato.

La influencia de la temperatura en la velocidad ha suministrado informaci�n valiosa acerca de los mecanismos enzim�ticos. Sin embargo, una complicaci�n surge del hecho de que las enzimas por s� mismas experimentan un proceso de desactivaci�n que tiene una energ�a de desactivaci�n muy alta, por lo que a 35�C o m�s (dependiendo de la enzima) se puede observar una desactivaci�n muy r�pida. Por ello es frecuente encontrar que las velocidades catalizadas por enzimas pasan por un m�ximo al ir subiendo la temperatura. A 60�C por ejemplo, muchas propiedades de la enzima se alteran, algunas de ellas irreversiblemente. Estos cambios se conocen con el nombre de desnaturalizaci�n y son los responsables del decrecimiento de la actividad de la enzima.

TABLA 1. Efecto catal�tico de algunas enzimas para diferentes reacciones.

Reacción	Catalizador	T° C	k	k0	E Kcal/mol
Hidrólisis de la urea	H3O+	62.0	7.4X10-7	1.8X1010	24.6
"	ureasa	20.8	5.0x106	1.7x1013	06.8
Hidrólisis de trifosfato de adenosina	H3O+	40.0	4.7x10-6	2.4x109	21.2
"	miosina	25.0	8.2x106	1.6x1022	21.1
Descomposición del H2O2	Fe++	22.0	56	1.8x109	10.1
"	catalasa	22.0	3.5x107	6.4x108	01.7

En la tabla 1 se dan los valores de las constantes de velocidad, energ�as de activaci�n y factores preexponenciales de tres reacciones catalizadas por enzimas y se incluyen a t�tulo de comparaci�n los valores de otros catalizadores.